張 媛 ，賀桂芳 ，?，卞美璐

（1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029）

生物標(biāo)記物對于宮頸癌的診治和研究進(jìn)展

張 媛1，賀桂芳1，2?，卞美璐2

（1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029）

宮頸癌發(fā)病率在全球女性腫瘤中位居第3位，在發(fā)展中國家位居第2位[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估算，全球每年約53萬女性發(fā)生宮頸癌，27.5萬女性死于宮頸癌。宮頸癌在多數(shù)發(fā)展中國家，占女性腫瘤死因的第一位[2]。我國宮頸癌每年新發(fā)病例為13萬例，占世界宮頸癌每年新發(fā)病例的28%。HPV的持續(xù)感染是其發(fā)生的必要條件。宮頸癌上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasias，CIN）Ⅰ～Ⅲ是重要的宮頸癌前病變，臨床上迫切需要更為簡便、有效的檢測手段，協(xié)助醫(yī)生更早發(fā)現(xiàn)病變；在避免過度治療的同時(shí)減少漏診，及時(shí)給予恰當(dāng)?shù)呐R床干預(yù)。運(yùn)用生物標(biāo)志物輔助細(xì)胞形態(tài)學(xué)篩查，有利于更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)高級別宮頸病變，從而及時(shí)采取干預(yù)措施，達(dá)到一級預(yù)防的目的。細(xì)胞腫瘤抑制蛋白P16以及Ki67已經(jīng)確定為分子標(biāo)記物來檢測病變嚴(yán)重程度進(jìn)展及預(yù)后[3]，因此P16和Ki67的表達(dá)對于宮頸癌的發(fā)展有重要的臨床意義[4]。

1 生物標(biāo)記物檢測

1.1 P16與CIN的關(guān)系

P16基因是一個(gè)多腫瘤抑制基因，主要作用在于能夠直接參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶CDK4／CDK6的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入s期。P16基因的失活將導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞異常增殖而癌變。該基因產(chǎn)物對CDK4的活性具有抑制作用，因而也稱為P16 INK4（INK4，inhibitor of CDK4）。 細(xì)胞周期依賴蛋白激酶抑制劑P16和細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原Ki67與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)。兩者在子宮頸癌中表達(dá)的升高可能與HPVE7蛋白的過度表達(dá)引起的Rb失活從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的E2F基因表達(dá)增高有關(guān)。

P16的高表達(dá)與宮頸癌有一定的相關(guān)性，在組織病理學(xué)中這一結(jié)論已經(jīng)得到證實(shí)[5]。 Tsoumpou在61例研究中，通過META分析得出結(jié)論，P16免疫染色在病變的細(xì)胞學(xué)和病理學(xué)中的相關(guān)性。報(bào)道指出，P16在細(xì)胞學(xué)顯示為異常的時(shí)候表達(dá)率明顯增高。組織學(xué)顯示，在正常組織中表達(dá)為2%，在CIN1中表達(dá)為38%，在CIN2中表達(dá)為68%，在 CIN3中表達(dá)為 82%[6]。 Roelens等[7]對 P16 INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色與人乳頭瘤病毒基因檢測HC-Ⅱ?qū)SCUS和LSIL的分流能力做了薈萃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P16 INK4a預(yù)測ASCUS和LSIL進(jìn)展為高級別子宮頸病變的敏感度分別為83.2%、83.8%，特異度分別為71.0%、65.7%，與HC-Ⅱ相比，兩者的敏感度相近，但前者的特異度較高。

研究發(fā)現(xiàn)，在基線為CINⅠ的患者，p16 INK4a陽性與陰性婦女相比，2年后進(jìn)展為高級別子宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)前者是后者8.25倍，表明p16 INK4a的過度表達(dá)與子宮頸病變程度相關(guān)，低級別子宮頸病變組織中P16 INK4a過度表達(dá)能對其以后進(jìn)展為高級別子宮頸病變具有預(yù)測能力[8]。進(jìn)而可以大膽預(yù)測，在CIN2級別病變中，P16陽性與陰性婦女對比，未來進(jìn)展為更高級別子宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)會明顯增加，因而P16蛋白可以作為有效的指標(biāo)指導(dǎo)CIN2級別病變的臨床治療。

1.2 Ki67與CIN的關(guān)系

Ki67的表達(dá)與細(xì)胞增殖活動性密切相關(guān)，既往研究中發(fā)現(xiàn)，Ki67在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌組織中隨病情嚴(yán)重程度加重，進(jìn)而表達(dá)水平逐步升高。而且在CIN1、CIN2及CIN3之間Ki67的陽性表達(dá)也存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這提示Ki67可以視為一種反應(yīng)宮頸上皮內(nèi)細(xì)胞異型性的比較靈敏的標(biāo)志物。Kruse等通過免疫定量法研究進(jìn)一步證實(shí)了Ki67有較強(qiáng)的預(yù)測宮頸病變發(fā)展趨勢的價(jià)值，其可靠性甚至超過了CIN分級[9]。Alameda等研究結(jié)果顯示，Ki67在低級別CIN、高級別CIN和浸潤癌組織標(biāo)本中的陽性表達(dá)分別為25%、68%和85.5%，表明宮頸病變嚴(yán)重程度和Ki67的表達(dá)水平呈正相關(guān)[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，52個(gè)CIN宮頸錐切的標(biāo)本中，Ki67的表達(dá)在CINⅢ中較CINⅠ、CINⅡ高。用Ki67的免疫定量法及傳統(tǒng)的CIN分級及人乳頭瘤病毒 （human papillomavirs，HPV）感染狀態(tài)在預(yù)測CINⅠ、Ⅱ是否發(fā)展為CINⅢ方面進(jìn)行比較，Ki67具有更強(qiáng)的預(yù)測性[12]。

Ki67表達(dá)的陽性率隨著宮頸癌臨床分期的升高而增加，低分化腫瘤組織中的表達(dá)水平高于高分化腫瘤組織，提示Ki67的高表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到一定作用，其表達(dá)水平可以判斷疾病預(yù)后。也有研究學(xué)者提出Ki67可以作為宮頸癌轉(zhuǎn)移的一種預(yù)測指標(biāo)。Silva的研究中，觀察組作為宮頸癌患者治性術(shù)后的標(biāo)本，對照組為子宮因良性腫瘤而切除的標(biāo)本。Ki67的表達(dá)在觀察組組織學(xué)陽性標(biāo)本中均比在對照組中的陽性表達(dá)顯著增高。Kimura等認(rèn)為從CINⅠ中 Ki67的標(biāo)記指數(shù)在累及腺體部位的腫瘤逐漸增加，表明Ki67的免疫染色對累及腺體部位的CIN是一種有用的病理診斷指標(biāo)。Kamer認(rèn)為Ki67能夠作為一個(gè)反應(yīng)細(xì)胞增殖的慚怍在宮頸癌中被使用，在腫瘤早期，Ki67的變化能預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性[13]。1.3 P16+Ki67聯(lián)合檢測及意義

P16和Ki67的雙染色在宮頸癌患者中應(yīng)用廣泛。Wentzensen等對CINtes Plus技術(shù)預(yù)測子宮頸癌前病變進(jìn)行了評估，研究納入了625例轉(zhuǎn)型陰道鏡檢查的婦女，結(jié)果顯示，在正常子宮頸中、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組織中 P16和 Ki67的陽性率分別為26.8%、46.5%、82.8%、92.8%，陽性率隨著病理級別升高呈增高趨勢[14]。在776里患者中P16跟Ki67的雙染色的敏感性分別為92.2%在ASCUS和在低級別SIL中94.2%特異性分別為80.6%和68%。因此雙染色對比單獨(dú)P16單染色在HPV感染患者中具有更高的特異性。雙染色具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。在歐洲，通過27456為患者通過細(xì)胞學(xué)雙染色與HPV（HCⅡ）檢測，顯示細(xì)胞學(xué)雙染色對于CINⅡ或者更高級別病變中有更高的診斷價(jià)值。

2 其他生物標(biāo)記物

2.1 微小染色體維持蛋白2（MCM2）

最近研究表明，微小染色體維持蛋白和拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅡA蛋白共同表達(dá)在HPV感染的細(xì)胞的不正常的細(xì)胞周期S期，并且增加HPV E6/E7蛋白的表達(dá)，因此很有可能成為宮頸癌的生物預(yù)測指標(biāo)[15，16]。微小染色體維持蛋白2是真核細(xì)胞DNA復(fù)制啟動的許可因子[17]。其在增殖細(xì)胞中表達(dá)水平高，在靜止細(xì)胞和分化的細(xì)胞中不表達(dá)或者表達(dá)水平很低。這使得其可作為不典型增生和腫瘤的生物學(xué)標(biāo)記物。在病變細(xì)胞中的表達(dá)及分布逐漸從基底層向表皮推移，直至上皮全層。通過檢測MCM2蛋白在不典型增生細(xì)胞中的水平，可預(yù)測腫瘤進(jìn)展情況。Rosamilia等[18]研究發(fā)現(xiàn)，從正常宮頸上皮到CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ，MCMⅡ蛋白陽性表達(dá)逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)78例宮頸癌Ⅱ期患者放療后手術(shù)切除標(biāo)本的MCM2在38例放射抵抗組中有31例（81．5%）陽性，而40例放射敏感組中只有28例陽性，認(rèn)為MCM2可作為評估腫瘤放療療效的指標(biāo)。MCM2直接調(diào)控真核細(xì)胞復(fù)制的啟始。其異常表達(dá)反映了具有癌變潛能的細(xì)胞被鎖定在細(xì)胞周期中不斷地進(jìn)行異常復(fù)制、增殖，并與一些腫瘤的臨床生物學(xué)特征及預(yù)后密切相關(guān)。檢測MCMⅡ的表達(dá)有助于宮頸病變的診斷和預(yù)后評價(jià)，而關(guān)閉MCMⅡ的表達(dá)則可能成為宮頸病變治療的新靶點(diǎn)。

2.2 MiRNAs

miRNAa是一段小的沒有編碼的RNA調(diào)節(jié)基因，它的高表達(dá)跟人類的很多腫瘤有關(guān)，包括宮頸癌[19]。一些miRNA， 例如 miR-9、miR-127、miR-145、miR-146a、miR-199a、miR-200a和miR-424，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞中失控[20，21]。Hou等[22]用RT-PCR檢測宮頸癌細(xì)胞株和癌組織，發(fā)現(xiàn)miR-196a顯著高表達(dá)，用克隆形成試驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)等方法進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)FOXO1及p27Kip1為其靶基因，而后兩者為PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵因子。通過上調(diào)miR-196a可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，推測miR-196a在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中具有抑癌基因的作用。Kogo等[23]對79例宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-218在宮頸癌患者中表達(dá)水平顯著下調(diào)，miR-218低水平預(yù)示著更低的生存率及更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，miR-218過表達(dá)可以抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。研究證實(shí)人乳頭瘤病毒（HPV），尤其高危型HPV16及HPV18的感染與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Yu等[24]報(bào)道HPV16可以上調(diào)miR-92的表達(dá)，后者通過下調(diào)PTEN促進(jìn)SiHa的增殖性和侵襲性，PTEN是一種腫瘤抑制因子，通過阻止細(xì)胞生長、分裂的速度過快或者分裂不受控制的方式，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞分裂周期。Zhang等[25]報(bào)道外源性miR-129-5p可以抑制HeLa細(xì)胞HPV18的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此HPV感染中MiRNA的差異表達(dá)對宮頸癌診治方法、探索具有治療意義的生物靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。2.3 其他生物標(biāo)記物

除上述生物標(biāo)記物外，還有一些與HPV感染或細(xì)胞增殖相關(guān)的標(biāo)志物可能會成為子宮頸癌篩查的新指標(biāo)。Brn-3a是POU家族細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的一員，主要在神經(jīng)和子宮頸細(xì)胞中表達(dá)，在HPV上游調(diào)節(jié)區(qū)和子宮頸癌細(xì)胞的增殖中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Brn-3a表達(dá)與子宮頸病變級別的增高相關(guān)，提示其可以作為細(xì)胞學(xué)篩查的輔助診斷工具。禽急性成髓細(xì)胞白血病病毒致癌基因同源基因2是編碼DNA結(jié)合蛋白的MYB原癌基因家族的一員，與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)，在子宮頸癌、子宮頸腺癌、CIN組織中過度表達(dá)，其能否作為子宮頸癌篩查的指標(biāo)還需進(jìn)一步證實(shí)。生存素屬于凋亡蛋白抑制家族成員，參與細(xì)胞的分裂和凋亡，在子宮頸癌中呈過度表達(dá)狀態(tài)，并隨子宮頸病變級別的升高而升高，還與HPV感染相關(guān)，目前還需要更大范圍的研究評價(jià)其能否用于子宮頸癌篩查。

3 臨床意義和展望

目前我國對于宮頸病變存在過度診治的現(xiàn)象，尤其是對CINⅡ的患者；P16及Ki67對于CIN的診斷有極好的指導(dǎo)作用；單純的病理診斷取決于閱片者的水平和主觀性；缺少足夠的靈敏度和特異度；而結(jié)合免疫組化可以增加宮頸病變診斷的準(zhǔn)確性，P16聯(lián)合Ki67在宮頸組織的表達(dá)有助于確診宮頸病變的分級，可以減少宮頸病變的過度診治，如CINⅡ的患者會進(jìn)行宮頸錐切手術(shù)。對有生育要求的患者，縮短女性宮頸的長度并降低患者宮頸承托力，該手術(shù)影響女性妊娠期間宮頸功能而容易導(dǎo)致早產(chǎn)。宮頸錐切術(shù)切除了女性宮頸部分分泌黏液的組織，明顯影響宮頸黏液分泌，而含有抑菌物質(zhì)的宮頸黏液分泌減少，明顯增加了病原微生物進(jìn)入女性生殖系統(tǒng)的概率，進(jìn)而增加患者流產(chǎn)、胎膜早盤和早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。如結(jié)合免疫組化P16及Ki67表達(dá)為陰性，可以采取觀察,從而減少宮頸病變給患者帶來的經(jīng)濟(jì)及心理壓力。因此，P16和Ki67的聯(lián)合檢測，對于預(yù)測CINⅡ患者病情進(jìn)展，以及減少不必要的宮頸錐切術(shù)并避免漏診，具有一定的臨床價(jià)值。

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R711.74

A

1001-0025（2017）05-0307-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.05.013

1，2* 本文通訊作者。

張 媛（1990-），女，碩士研究生。

2017-04-17

2017-06-05