陳春宇,于 崢，陳小野

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,北京 100700)

【理論探討】

肝纖維化從腎論治探討?

陳春宇,于 崢，陳小野△

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,北京 100700)

肝纖維化的主要病機是腎虛應(yīng)從腎論治。中醫(yī)認(rèn)為“虛極及腎”，從病程、肝細胞再生能力、肝細胞端粒長度、卵圓細胞、肝細胞EMT現(xiàn)象、甲胎蛋白、白蛋白、肥大細胞、TGF-β通路、Wnt/β-catenin通路等方面看，肝纖維化時肝細胞的再生能力轉(zhuǎn)而弱于間質(zhì)的增殖修復(fù)能力，說明肝細胞生機不足；肝組織開始出現(xiàn)胚胎化特征，說明已“損及胎元”，所以肝纖維化應(yīng)從腎論治。目前對肝纖維化的辨證主要有肝郁脾虛、肝腎陰虛、脾腎陽虛、瘀血阻絡(luò)、濕熱中阻和氣滯血瘀，從腎論治為主者極少。在肝纖維化病理中，如果主要著眼于“纖維”就會更注重 “實證”；如果主要著眼于“肝細胞”就會更注重 “虛證”。盡管肝細胞占肝臟細胞總數(shù)超過80%，但在肝纖維化過程中的病理生理作用一直被忽略。即使目前重視程度提高，但主要也集中在其產(chǎn)生纖維方面的作用，而相對忽視其衰老和增殖修復(fù)能力下降。

肝纖維化；肝細胞；生機；胎元；從腎論治

肝纖維化(HF)是指肝細胞發(fā)生壞死或肝組織炎癥刺激時，肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織增生與分解失衡，從而在肝內(nèi)異常沉積的病理過程，是多種慢性肝病的重要病理特征和發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段[1]。肝纖維化的主要病機是腎虛，應(yīng)從腎論治。

中醫(yī)認(rèn)為“虛極及腎”。肝纖維化時，一是肝細胞的再生能力轉(zhuǎn)而弱于間質(zhì)的增殖修復(fù)能力，說明肝細胞生機不足；二是肝組織開始出現(xiàn)胚胎化特征。說明已“損及胎元”。所以，肝纖維化時虛損程度雖未及肝硬化以及進一步的肝癌，但也初步可言“虛極”(及腎)了。

1 肝纖維化時肝細胞再生能力不足以及肝組織出現(xiàn)胚胎化特征的表現(xiàn)

1.1 病程長

久病必虛，肝損傷至少要持續(xù)數(shù)月到數(shù)年才可引起肝纖維化[2]。

1.2 肝細胞再生能力不足

正常的肝再生依“肝細胞和膽管上皮細胞→類竇壁血管內(nèi)皮細胞、貯脂細胞、枯否細胞→纖維母細胞”的順序進行。肝纖維化時肝細胞再生緩慢，這一順序失去平衡[3]。長期給予CCl4造成大鼠肝纖維化或肝硬化后，通過[3H]摻入法證實，肝細胞的反應(yīng)性增殖能力減弱，與細胞增殖過程密切相關(guān)的細胞周期蛋白B、D1和E等表達也降低。用酒精加CCl4進行肝纖維化造模8周，PCNA(增殖細胞核抗原)兔疫組化顯示，造模8周末雖然肝細胞增殖能力強于正常組，但與造模5周末相比明顯下降[4]。

1.3 肝細胞端?？s短

細胞端粒的長度關(guān)系到其分裂的次數(shù)。肝纖維化時肝細胞端?？s短，再生能力降低，這是肝細胞衰老的表現(xiàn)之一。肝硬化時，肝細胞端粒的縮短更為明顯[5]。

1.4 肝細胞再生能力不足，卵圓細胞參與肝再生

正常成人及成年動物肝臟的肝小葉內(nèi)都是分化成熟的肝細胞，很少見到核分裂。約10000或100 000個肝細胞中可見到1個核分裂[6]。當(dāng)肝細胞受損時，成熟的肝細胞進行分裂增殖以修復(fù)。如肝細胞的再生能力不足，則干細胞(如卵圓細胞)參與肝再生[5]。

肝卵圓細胞(HOCs)最先由Opie EL．在1944年描述，一般認(rèn)為它具有肝臟“干細胞”性質(zhì)，具有無限增殖以及分化為成熟肝細胞和膽管細胞的能力。通常情況下，在正常的肝臟內(nèi)并不能檢測到卵圓細胞[7]。肝纖維化時，肝卵圓細胞活化[8]說明肝細胞再生能力不足。

1.5 肝細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象實質(zhì)是胚胎化

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指成熟的上皮細胞喪失部分上皮細胞特征，如細胞間連接丟失、細胞極性喪失，獲得了一些間質(zhì)細胞的特征，如浸潤性和遷移游走能力。1982年，Greenburg和Hay在培養(yǎng)晶狀體上皮細胞時首先提出EMT的概念。已證實，在腎纖維化、肺纖維化、腹膜纖維化和晶狀體纖維化中有EMT的發(fā)生。多項臨床、動物、細胞學(xué)實驗表明，肝纖維化時肝細胞也出現(xiàn)EMT現(xiàn)象[9]。

在個體發(fā)育上，EMT見于胚胎時期，但在成年生物，“終末分化”的上皮細胞則呈現(xiàn)出表型穩(wěn)定的狀態(tài)，除在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中其表型可發(fā)生轉(zhuǎn)化外，其余時期成熟上皮細胞在細胞分化上則表現(xiàn)為靜默[10]，所以肝纖維化時肝細胞的EMT現(xiàn)象實質(zhì)上是胚胎化。

此外，具有分化為肝細胞和膽管上皮細胞雙向潛能的小鼠及人肝祖細胞體外培養(yǎng)，可以共表達上皮細胞標(biāo)志和間充質(zhì)細胞標(biāo)志，也揭示了肝細胞EMT現(xiàn)象的胚胎化實質(zhì)[9]。

1.6 卵圓細胞即是胚胎性細胞

卵圓細胞的胚胎性特征如Jose Uriel指出，肝細胞非癌性再生時，如肝部分切除、急性病毒性肝炎和中毒等，在肝再生結(jié)節(jié)中觀察到多量不成熟的卵圓形細胞。此時，患者血清中一過性地出現(xiàn)一些胚胎性抗原和胚胎型同工酶[11]。AFP(甲胎蛋白)mRNA (2.1kb)在部分卵圓細胞以及少數(shù)靠近卵圓細胞的小肝細胞及/或肝細胞均呈陽性反應(yīng)。AFP免疫組化結(jié)果大部分與其mRNA雜交結(jié)果相符[6]。

1.7 甲胎蛋白開始出現(xiàn)陽性

1963年，蘇聯(lián)Abelev發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌產(chǎn)生AFP。AFP是一種胎兒早期的血清蛋白，由胎肝細胞、胚胎前腸和卵黃囊內(nèi)胚層細胞合成，出生后第4～5天下降到胎兒早期水平的一半，數(shù)月后即處于難以檢測的數(shù)量值[6]。正常人的肝細胞失去合成AFP的能力[12]。

所以，肝纖維化時AFP開始出現(xiàn)陽性的實質(zhì)上是胚胎化。如王暉等對66例慢性肝病患者的肝活檢和外周血清中透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型膠原(PⅢP)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)和AFP的檢測表明，AFP可隨肝臟炎癥纖維化的升級，異常率明顯增高，S4可達50%。在B超、CT或MRI排除肝臟腫瘤后，肝纖維化是AFP升高的一個重要因素，同時AFP的異常對于判別肝纖維化也有重要的參考價值[13]。

1.8 成熟肝細胞合成的白蛋白減少

AFP和白蛋白(ALB)是肝細胞在不同分化階段的產(chǎn)物，成熟肝細胞僅合成ALB。胎肝的肝細胞產(chǎn)生AFP，至胎后期隨著肝細胞的成熟向ALB轉(zhuǎn)化[14]。肝纖維化時，肝臟合成ALB減少[15]。

1.9 肝組織肥大細胞浸潤符合虛證病理

1.9.1 正常人肝臟內(nèi)有少量肥大細胞(MC)存在[16]

1.9.2 肝纖維化時肝組織肥大細胞浸潤 如賈晉斌等用復(fù)合因素建立大鼠肝纖維化模型，分別于實驗第2、4、6、8周末取樣觀察相關(guān)指標(biāo)。經(jīng)肝組織TB染色(甲苯胺藍染色示MC)、ABS染色(Alcian藍+藏紅染色)、硫酸小檗堿熒光染色(示肝素)和電鏡觀察，以及肝組織組胺濃度測定，證明肝纖維化進展過程MC功能活躍的同時，出現(xiàn)增殖[17]。

1.9.3 肥大細胞在肝纖維化中發(fā)揮作用 近年來，越來越多的研究表明，肥大細胞也參與肝纖維化過程。有研究表明，在肝纖維化過程中，隨著MC數(shù)目的增多，組胺、類蛋白酶及類胰蛋白酶等MC活性介質(zhì)大量釋放，其釋放的量與肝纖維化程度及膠原合成呈正相關(guān)[16]。

1.9.4 肥大細胞功能活躍的過敏性疾病，如支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎等，其主要病機均是陽氣虛[18]。

1.9.5 肝纖維化時，浸潤于肝組織中的肥大細胞受膽堿能神經(jīng)(副交感神經(jīng))支配[16]，而副交感神經(jīng)在陽虛時興奮性增強。

1.10 TGF-β通路激活的實質(zhì)是胚胎化

TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)是Tucker在1984年發(fā)現(xiàn)的一種與多種腫瘤生長相關(guān)的多肽性細胞生長調(diào)節(jié)因子，與肝臟損傷及疾病發(fā)生關(guān)系密切。

1.10.1 TGF-β通路在胚胎期(包括肝臟和肝細胞)發(fā)揮重要作用 如張曉等用免疫細胞化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，在胚胎第51天，肝、腦室和脊髓等組織器官中均有TGF-β陽性細胞存在。胚胎時期，人的肝組織是合成TGF-β的主要部位，約占血液TGF-β總量的90%。對12～20周胚胎組織進行免疫組化研究觀察到，呈TGF-β陽性反應(yīng)的肝細胞可占總數(shù)的70%[19]。

1.10.2 TGF-β在成年肝臟特別是肝細胞表達不明顯 盡管存在不同結(jié)果，但總的來說TGF-β在成年肝臟特別是肝細胞表達不明顯[20]。

1.10.3 肝纖維化時TGF-β通路的激活其實質(zhì)是胚胎化 肝纖維化時TGF-β通路激活，如研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化時TGF-β1明顯增高，而且其增高總是與膠原、Fn(纖維連接蛋白)、蛋白聚糖、Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PⅢP)等反映肝纖維化指標(biāo)的增加相伴隨[20]。

1.10.4 EMT主要通過TGF-β1通路調(diào)節(jié) 涉及EMT的信號通路有許多，研究較多的有TGF-β通路、Wnt通路。TGF-β通路是作用較明確的誘導(dǎo)EMT的信號通路[21]。

1.11 Wnt/β-catenin通路激活實質(zhì)是胚胎化

Wnt基因于1982年由Nusse和Varmus研究發(fā)現(xiàn)。Wnt信號通路有經(jīng)典和非經(jīng)典兩種，經(jīng)典Wnt信號通路，即Wnt/β-catenin(β連環(huán)蛋白)信號通路。這也是目前研究較多且較為清楚的Wnt信號通路。

1.11.1 Wnt/β-catenin通路在胚胎期(包括肝臟和肝細胞)發(fā)揮重要作用 如萬贊燕等述，Wnt信號被證實在肝臟胚胎分化發(fā)育中具有重要作用，如引起肝臟體積的增大及肝細胞數(shù)量的增多等[22]。

1.11.2 Wnt/β-catenin在成年肝臟、肝細胞表達不明顯 正常機體組織細胞中沒有Wnt信號，胞質(zhì)中僅有少量游離態(tài)的β-catenin。用RT-PCR檢測大鼠正常肝組織未檢測到Wnt1、cyclin-D1(細胞周期蛋白-D1)以及c-myc等mRNA的轉(zhuǎn)錄，免疫組化檢測到β-catenin蛋白在肝細胞膜處呈弱陽性表達[23]。

1.11.3 肝纖維化時Wnt/β-catenin通路的激活其實質(zhì)是胚胎化 肝纖維化時，Wnt/β-catenin通路激活。如孫利兵等述，以往的研究表明，Wnt信號通路與肺纖維化、腎纖維化的形成密切相關(guān)。近年來的研究證實，Wnt信號通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究證實，Wnt信號傳導(dǎo)通路在HSC的活化和增殖中發(fā)揮著重要作用[23]。

2 結(jié)語

中醫(yī)認(rèn)為“虛極及腎”，從病程、肝細胞再生能力、肝細胞端粒長度、卵圓細胞、肝細胞EMT現(xiàn)象、甲胎蛋白、白蛋白、肥大細胞、TGF-β通路、Wnt/β-catenin通路等方面看，肝纖維化時，肝細胞的再生能力轉(zhuǎn)而弱于間質(zhì)的增殖修復(fù)能力，說明肝細胞生機不足。同時肝組織開始出現(xiàn)胚胎化特征，說明已“損及胎元”，所以肝纖維化的主要病機是腎虛，應(yīng)從腎論治。

目前對肝纖維化的辨證主要有肝郁脾虛、肝腎陰虛、脾腎陽虛、瘀血阻絡(luò)、濕熱中阻和氣滯血瘀[24]，從腎論治為主者極少。

在肝纖維化病理中，如果主要著眼于“纖維”，就會更注重 “實證”；如果主要著眼于“肝細胞”，就會更注重 “虛證”。

盡管肝細胞占肝臟細胞總數(shù)超過80%，但在肝纖維化過程中的病理生理作用一直被忽略[10]。即使目前重視程度提高，但主要也集中在其產(chǎn)生纖維方面的作用，如合成膠原基質(zhì)、合成非膠原基質(zhì)、合成基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、合成細胞因子及細胞因子結(jié)合蛋白、表達細胞外基質(zhì)受體、調(diào)節(jié)ECM(細胞外基質(zhì))降解、表達細胞黏附分子、合成一氧化氮和一氧化氮合成酶iNOSmRNA、表達原癌基因、肝細胞EMT等[25]，而相對忽視其衰老和增殖修復(fù)能力下降。

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R575.1

A

1006-3250(2017)09-1211-03

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金自主選題項目(YZ-1660)-補腎法對肝纖維化大鼠的干預(yù)作用及對TGF-β/Smad信號通路的影響

陳春宇(1989-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，在讀博士，從事中醫(yī)診法與證候研究。

陳小野，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，Tel：13671340726，E-mail：chenxiaoye1@sina.com。

2017-03-08