岳秀英，葛榮，吳曉嵐，陸強(qiáng)，孫吉，寧宜寶，鄒立扣

(1．四川省獸藥監(jiān)察所，四川成都610041;2．中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀100081; 3．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川都江堰611830)

四川省豬、雞源大腸桿菌對(duì)抗生素耐藥性研究

岳秀英1，葛榮1，吳曉嵐1，陸強(qiáng)1，孫吉1，寧宜寶2，鄒立扣3

(1．四川省獸藥監(jiān)察所，四川成都610041;2．中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀100081; 3．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川都江堰611830)

對(duì)四川省2009－2014年共2 954株豬、雞源大腸桿菌進(jìn)行13種抗生素耐藥性測(cè)定，同時(shí)對(duì)耐頭孢噻呋大腸桿菌及O157菌株耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:大腸桿菌對(duì)抗生素耐藥譜廣，多重耐藥嚴(yán)重。大腸桿菌對(duì)抗生素耐藥率呈逐年波動(dòng)下降趨勢(shì)，豬源大腸桿菌對(duì)抗生素耐藥率總體耐藥率為40.40%～92.32%，抗生素耐藥率依次為:TET(92.32%)＞SIZ (91.96%)＞AMP(91.25%)＞SXT(87.56%)＞DO(77.67%)＞FFC(73.97%)＞SH(69.91%)＞EN(66.00%)＞AMC (61.10%)＞OFX(59.39%)＞CN(57.82%)＞PME(42.53%)＞CEF(40.40%)。雞源大腸桿菌對(duì)抗生素的總體耐藥率為9.17%－89.41%，抗生素耐藥率依次為:SIZ(89.41%)＞AMP(85.01%)＞SXT(83.40%)＞TET(83.01%)＞EN(72.03%)＞OFX(63.37%)＞AMC(62.14%)＞DO(58.90%)＞FFC(55.10%)＞SH(50.52%)＞CEF(46.9%)＞CN(33.91%)＞PME(9.17%)。2009年－2014年豬源大腸桿菌耐藥率總體高于雞源大腸桿菌。研究表明，監(jiān)測(cè)大腸桿菌的抗生素耐藥性對(duì)動(dòng)物的養(yǎng)殖、疾病的預(yù)防及耐藥性的控制有著重要意義。

豬;雞;大腸桿菌;抗生素;耐藥性

隨著畜禽養(yǎng)殖中治療或預(yù)防性使用的抗菌藥物的廣范使用，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，多重耐藥菌株不斷增加，給我國(guó)畜禽業(yè)發(fā)展和人類健康帶來(lái)了極大危害。大腸桿菌頭孢噻呋抗菌性強(qiáng)，抗菌譜廣，是獸醫(yī)常用于治療大腸桿菌疾病的藥物。大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸桿菌主要血清型，是引起出血性腸炎的主要病原菌。本研究通過(guò)對(duì)四川2009－2014年豬、雞源大腸桿菌耐藥性測(cè)定，并對(duì)耐頭孢噻呋的大腸桿菌及大腸桿菌O157耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，分析大腸桿菌耐藥性及耐藥基因情況，旨在為養(yǎng)殖業(yè)中大腸桿菌病的防治提供用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1．1 樣品采集2012—2014年間從養(yǎng)殖場(chǎng)采取(雞:泄殖腔拭子，豬:肛門拭子)樣品，保存于冰盒中，48 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。

1．2 培養(yǎng)基及試劑

1．2．1 培養(yǎng)基TSB培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，TSA培養(yǎng)基，MHA培養(yǎng)基，NB培養(yǎng)，LB培養(yǎng)基，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1．2．2 抗生素β－內(nèi)酰胺/抑制劑類:阿莫西林/克拉維酸(AMC)、氨芐西林(AMP);頭孢類:頭孢塞呋(CEF)、頭孢唑啉(CFZ);氨基糖苷類:阿米卡星(AK)、慶大霉素(CN)、大觀霉素(SH);四環(huán)素類:四環(huán)素(TET)、多西環(huán)素(DO);氯霉素類:氟苯尼考(FFC);多黏菌素類:多黏菌素E(PME);磺胺類:復(fù)方新諾明(SXT)、磺胺異噻唑(SIZ);氟喹諾酮類:恩諾沙星(EN)、氧氟沙星(OFX);以上試劑購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。

1．3 菌株分離、鑒定大腸桿菌的分離、鑒定取拭子樣品直接接種于麥康凱瓊脂平板，動(dòng)物組織樣品首先制成勻液，然后接種于麥康凱瓊脂平板，(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。挑取大腸桿菌可疑菌落，用麥康凱培養(yǎng)基純化一代，然后接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，(36±1)℃培養(yǎng)16 h～24 h。挑選待鑒定細(xì)菌的5～7個(gè)單個(gè)菌落，采用自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1．4 藥敏試驗(yàn)根據(jù)CLSI推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定大腸桿菌的耐藥表型［1］，以大腸桿菌ATCC25922及ATCC35218為質(zhì)控菌株。

1．5 耐藥基因檢測(cè)對(duì)耐頭孢噻呋大腸桿菌及大腸桿菌O157:H7菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)。大腸桿菌sul1、sul2、sul3耐藥基因引物參照Z(yǔ)hou等［2］，qnrA、qnrB、qnrS、qepA耐藥基因引物參照Sánchez等［3］，tetA、tetB、tetC、tetG耐藥基因引物參照Cheng等［4］、Du等［5］，aph(3＇)－IIa、aac(3)－IIa、ant(3”)－Ia、aac(6’)－Ib耐藥基因引物參照Z(yǔ)hang等［6］，blaTEM、blaSHV、blaCTX－M耐藥基因引物參照田國(guó)寶等［7］，pmrA、pmrB、aadA1、aadA2、aadB耐藥基因引物參照鄒明等［8］，blaCMY耐藥基因引物參照Z(yǔ)hao等［9］，floR耐藥基因引物參照于學(xué)輝等［10］。

2 結(jié)果與分析

2．1 大腸桿菌流行情況2009－2014年，雞源大腸桿菌分離到1 548株，豬源大腸桿菌分離到1 406株，雞源大腸桿菌分離率總體呈現(xiàn)為波動(dòng)式降低趨勢(shì)，豬源大腸桿菌分離率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。2009－2014年檢測(cè)出23株大腸桿菌O157菌株。

2．2 大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥性

2．2．1 大腸桿菌對(duì)抗生素總體耐藥性2 954株大腸桿菌對(duì)13種抗菌藥物均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，耐藥率在25.05%～90.62%之間。大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥率依次為SIZ(90.62%)＞AMP (87.98%)＞TET(87.44%)＞SXT(85.38%)＞EN (69.16%)＞FFC(64.05%)＞AMC(61.65%)＞OFX(64.48%)＞DO(57.92%)＞SH(59.75%)＞CN(45.29%)＞CEF(43.81%)＞PME(25.05%)。從抗生素大類比較，大腸桿菌耐藥率依次為:磺胺類(85.38%～90.62%)＞青霉素類(87.98%)＞四環(huán)素類(57.92%～87.44%)＞氟喹諾酮類(61.48%～69.16%)＞氯霉素類(64.05%)＞加酶抑制劑類(61.65%)＞頭孢類(7.45%～43.81%)＞氨基糖苷類(45.29%)＞多黏菌素類(25.05%)。

2．2．2 豬源大腸桿菌耐藥性豬源大腸桿菌對(duì)抗生素總體耐藥率為40.40%～92.32%，抗生素的耐藥率依次為:TET(92.32%)＞SIZ(91.96%)＞AMP (91.25%)＞SXT(87.56%)＞DO(77.67%)＞FFC (73.97%)＞SH(69.91%)＞EN(66.00%)＞AMC (61.10%)＞OFX(59.39%)＞CN(57.82%)＞PME (42.53%)＞CEF(40.40)%。從抗生素大類比較，豬源大腸桿菌耐藥率依次為:磺胺類(87.56%～91.96%)＞青霉素類(91.25%)＞四環(huán)素類(77.67%～92.32%)＞氯霉素類(73.97%)＞氟喹諾酮類(59.39%～66%)＞氨基糖苷類(57.82%～69.91%)＞加酶抑制劑類(61.10%)＞多黏菌素類(42.53%)＞頭孢類(40.40%)。

2009－2014年分離豬源大腸桿菌耐藥率總體呈逐年波動(dòng)下降趨勢(shì)。2009年豬源大腸桿菌對(duì)AMC、AMP、TET、SIZ、SXT的耐藥率最高，分別為100%、100%、98.88%及97.21%、96.09%。2010年對(duì)AMC、AMP、TET、SIZ、SXT的耐藥率均下降，分別為76.33%、92.23%、95.05%、90.11%、92.23%。與2010年相比，2011年分離菌株對(duì)AMC、AMP、TET、SIZ、的耐藥率有上升趨勢(shì)，分別為97.50%、99.17%、95.83%、90.42%，而2012年及2013年分離菌株的AMC耐藥率卻下降為54.07%和8.46%。2013年分離菌株對(duì)13種抗生素耐藥率明顯普遍低于其他年份，耐藥率最高的抗生素為TET (84.08%)。

2．2．3 雞源大腸桿菌耐藥性雞源大腸桿菌對(duì)抗生素的總體耐藥率為9.17%～89.41%，抗生素的耐藥率依次為:SIZ(89.41%)＞AMP(85.01%)＞SXT (83.40%)＞TET(83.01%)＞EN(72.03%)＞OFX (63.37%)＞AMC(62.14%)＞DO(58.90%)＞FFC (55.10%)＞SH(50.52%)＞CEF(46.9%)＞CN (33.91%)＞PME(9.17%)。從抗生素大類比較，雞源大腸桿菌耐藥率依次為:磺胺類(83.40%～89.41%)＞青霉素類(85.01%)＞四環(huán)素類(58.90%～83.01%)＞氟喹諾酮類(63.37%～72.03%)＞加酶抑制劑類(62.14%)＞氯霉素類(55.10%)＞頭孢類(46.9%)＞氨基糖苷類(33.91%～50.52%)＞多黏菌素類(9.15%)。

2009－2014年分離豬源大腸桿菌耐藥率總體呈下降趨勢(shì)。2009年雞源大腸桿菌耐藥率最高的抗生素為SH(92.93%)和AMC(91.95%)，2010年為SH (92.93%)和SIZ(91.35%)，2011年為AMP (99.01%)及AMC(98.03%)。2012年耐藥率最高的為SIZ(93.85%)及AMP(93.46%)。2013年13種抗生素耐藥率明顯下降，耐藥率最高的為SIZ (79.30%)，最低的為AMC(1.40%)。2014年耐藥率最高的也是AMP(83.72%)。2009－2014年AMC耐藥率變化最大(1.40%～98.03%)，CEF、CN、PME耐藥率相對(duì)較低。

2009－2014年豬源大腸桿菌和雞源大腸桿菌對(duì)13種抗生素耐藥率趨勢(shì)大致相同，豬源大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥率高于雞源大腸桿菌，但AMC、CEF、EN、OFX四種藥物雞源大腸桿菌略高于豬源大腸桿菌。豬、雞源大腸桿菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類的耐藥性較其他抗生素偏高。

2．2．4 大腸桿菌多重耐藥情況表2表明，大腸桿菌表現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥性。雞源大腸桿菌的多重耐藥菌株占94.13%，其中耐受10種的抗生素菌株最多(15.89%);最多耐受13種抗生素(0.97%);雞源大腸桿菌多重耐藥譜最多的為AMC-AMP-CNDO-EN-FFC-CEF-OFX-SH-SIZ-SXT-TET(4.72%，n= 73)。豬源大腸桿菌多重耐藥菌株占96.52%，其中耐受12種的抗生素的菌株最多(14.44%)，最多耐受13種抗生素(9.74%);豬源大腸桿菌最多的多重耐藥譜是AMC-AMP-CN-EN-DO-FFC-CEF-OFX-PME-SH-SIZSXT-TET(9.74%，n=137)。

3 討論

2009－2014年分離2 954株大腸桿菌對(duì)13種抗生素呈現(xiàn)出不同程度耐藥，對(duì)SIZ的耐藥率達(dá)到90.62%，與其他研究結(jié)果相比，豬源、雞源大腸桿菌對(duì)13種抗生素耐藥率趨勢(shì)大致相同，對(duì)磺胺類、四環(huán)素類耐藥率最高。2009－2014年間AMP、AMC和SXT耐藥率呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，TET在6年間耐藥率一直較高，到2013年大腸桿菌對(duì)所有抗生素的耐藥性下降普遍至最低，2014年略有上升。

本研究中對(duì)2 954株大腸桿菌對(duì)13種抗生素進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，耐藥率達(dá)到80%以上的抗生素有4種，分別為SIZ、TET、AMP及SXT，建議這4種抗生素停用。尤其是SIZ和AMP已不再適合用于大腸桿菌病的臨床治療;耐藥率在50%～80%的藥物有6種，有些藥物在臨床停用邊緣，在使用時(shí)應(yīng)作為次選藥物;耐藥率在50%以下的藥物有3種，為CN、CEF及PME，藥物還處于敏感的范圍，在實(shí)際使用中要合理使用。養(yǎng)殖場(chǎng)的盲目用藥，不僅會(huì)加大經(jīng)濟(jì)成本，而且會(huì)錯(cuò)過(guò)最佳治療期導(dǎo)致疾病感染增加，還會(huì)進(jìn)一步加大細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，因此在動(dòng)物疾病治療中應(yīng)考慮合理、準(zhǔn)確用藥。

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S858．28

B

0529-6005(2017)01-0093-03

2016－01－11

農(nóng)業(yè)部“948項(xiàng)目”(2011－G14);教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”(IRT13083);國(guó)家自然科學(xué)基金(31400066)

岳秀英(1972－)，女，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，主要從事獸藥殘留和動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥研究工作，E－mail:582335538@ qq．com

葛榮，E－mail:582335538@qq．com