左振宇，葉 川

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430081)

可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的研究

左振宇，葉 川

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢 430081)

以脫脂、脫色后的蠶蛹蛋白粉為原料，選取堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)超聲處理后的蠶蛹蛋白溶液進(jìn)行單酶以及復(fù)合酶水解實(shí)驗(yàn)，以蛋白水解度、多肽得率和水解產(chǎn)物的抗氧化活性為指標(biāo)篩選出最適單酶和最適復(fù)合酶，采用響應(yīng)面法確定可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的最佳工藝條件為：選用堿性蛋白酶+中性蛋白酶(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶=1.3∶1)作為最適水解酶，超聲處理(10 min，工作3 s，間歇2 s)蠶蛹蛋白溶液，pH值 7.47、固液比1∶10(g∶mL)、加酶量2.1%、水解時(shí)間2.7 h、溫度59.2 ℃。在此工藝條件下，蛋白水解度為41.73%，多肽得率為33.29%，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率為59.48%、超氧陰離子自由基清除率為40.57%。

蠶蛹蛋白；活性多肽；可控酶解；抗氧化活性；水解度

蠶蛹蛋白是一種優(yōu)質(zhì)全價(jià)的蛋白資源[1]，占蠶蛹干重的45%～50%[2]。它含有18種氨基酸，其中包括占氨基酸總量40%以上的8種人體必需氨基酸[3]。蛋白質(zhì)水解可以產(chǎn)生具有生物活性功能的多肽，活性多肽是含有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)氨基酸組成的具有特殊生理功能的多肽片段[4]。不僅能滿(mǎn)足基本的氨基酸代謝需求和為人體生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還有其它重要的生理功能，如抗氧化、抗衰老等生物活性[5-6]。和蛋白質(zhì)相比，活性多肽在保持生物學(xué)活性的同時(shí)更容易被人體吸收代謝。目前，活性多肽的研究已經(jīng)成為食品行業(yè)和營(yíng)養(yǎng)等相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)課題。

蛋白質(zhì)的酶促降解過(guò)程會(huì)受到諸多因素(酶種類(lèi)、pH值、固液比、加酶量、水解時(shí)間、溫度、酶比例等)影響，通過(guò)控制水解條件達(dá)到可控酶解制備活性多肽的效果。作者以脫脂、脫色的蠶蛹蛋白粉為原料，以蛋白水解度、多肽得率、水解產(chǎn)物抗氧化活性為指標(biāo)，研究可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的工藝。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

蠶蛹由湖北省農(nóng)科院蠶業(yè)研究所提供；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，Biosharp公司；木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，Sigma公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；FA2004N型電子天平，奧豪斯國(guó)際商貿(mào)有限公司；1-14型離心機(jī)，Sigma公司；PB-10型pH計(jì)，Sartorius公司；GL-1800型干式恒溫器，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精宏公司；SB-5200DTN型超聲破碎儀，寧波新芝公司。

1.2 方法

1.2.1 單酶及復(fù)合酶的篩選

(1)單酶篩選。固定水解反應(yīng)的固液比、加酶量、水解時(shí)間、pH值、溫度，對(duì)蠶蛹蛋白溶液超聲處理后使用5種不同來(lái)源的蛋白酶進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。測(cè)定蛋白水解度、多肽得率以及水解產(chǎn)物的抗氧化活性，選擇水解效果最好的酶作為最適單酶體系。

(2)復(fù)合酶篩選。固定水解反應(yīng)的固液比、加酶量、水解時(shí)間、酶比例、pH值、溫度，對(duì)蠶蛹蛋白溶液超聲處理后使用不同蛋白酶組合進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。測(cè)定蛋白水解度、多肽得率以及水解產(chǎn)物的抗氧化活性，選擇水解效果最好的組合酶作為最適復(fù)合酶體系。

1.2.2 可控酶解工藝的確定及優(yōu)化

(1)單因素實(shí)驗(yàn)。使用最適復(fù)合酶體系可控酶解蠶蛹蛋白，研究不同單因素(pH值、固液比、加酶量、水解時(shí)間、溫度、酶比例)對(duì)酶解的影響，得到酶解工藝參數(shù)。

(2)響應(yīng)面優(yōu)化。采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析及優(yōu)化，確定可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的工藝并對(duì)優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 檢測(cè)方法

(1)多肽抗氧化活性檢測(cè)。選用羥基自由基清除法[7-11]和超氧陰離子自由基清除法[12-14]，通過(guò)兩種方法的相互驗(yàn)證最終確定蠶蛹蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化活性。

(2)水解度測(cè)定。水解度是蛋白水解的一個(gè)重要指標(biāo)，在水解過(guò)程中選用甲醛滴定法[15]對(duì)水解度進(jìn)行測(cè)定。

(3)多肽得率測(cè)定。采用TCA(三氯乙酸)沉淀蛋白法測(cè)定，離心取上清液加入雙縮脲試劑測(cè)定吸光值，并輔助卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)得[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單酶篩選

將蠶蛹蛋白溶液超聲處理(功率140 W，10 min，工作3 s，間歇2 s)后，選用5種蛋白酶進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)。設(shè)置水解反應(yīng)固液比1∶20(g∶mL，下同)，水解時(shí)間3 h，加酶量3%，pH值和溫度在各酶的最適pH值和最適溫度下進(jìn)行。測(cè)定蠶蛹蛋白水解度、多肽得率以及水解產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果如表1所示。

表1 5種單酶水解蠶蛹蛋白的效果/%

Tab.1 The effect of 5 kinds of single enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein/%

由表1可知，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白的水解效果較好，而木瓜蛋白酶、胃蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白的水解效果較差。同時(shí)堿性蛋白酶、中性蛋白酶水解蠶蛹蛋白多肽得率較高，水解產(chǎn)物也具有較強(qiáng)的抗氧化活性；而胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶水解蠶蛹蛋白多肽得率較堿性蛋白酶、中性蛋白酶的低，水解產(chǎn)物的抗氧化活性也較差。綜上，單酶水解蠶蛹蛋白效果最好的為堿性蛋白酶。

2.2 復(fù)合酶篩選

以堿性蛋白酶為基礎(chǔ)，將其它4種酶與堿性蛋白酶組合，對(duì)蠶蛹蛋白溶液超聲處理(功率140 W，10 min，工作3 s，間歇2 s)后，進(jìn)行復(fù)合酶水解實(shí)驗(yàn)，設(shè)置水解反應(yīng)固液比1∶20，水解時(shí)間3 h，加酶量3%，復(fù)合酶比例1∶1，pH值和溫度在各復(fù)合酶的最適pH值平均值和最適溫度平均值下進(jìn)行。測(cè)定蠶蛹蛋白水解度、多肽得率和水解產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果如表2所示。

表2 4種復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的效果/%

Tab.2 The effect of 4 kinds of compound enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein/%

由表2可知,堿性蛋白酶分別和中性蛋白酶、胰蛋白酶復(fù)合水解蠶蛹蛋白的水解度較大，多肽得率和水解產(chǎn)物的抗氧化活性很高，而和木瓜蛋白酶、胃蛋白酶復(fù)合水解蠶蛹蛋白的水解度、多肽得率、水解產(chǎn)物的抗氧化活性都相對(duì)較低。綜合比較，選擇堿性蛋白酶+中性蛋白酶作為最適復(fù)合酶體系。

2.3 復(fù)合酶水解單因素實(shí)驗(yàn)

初始反應(yīng)條件為:pH值 7.65、固液比1∶20、加酶量3%、水解時(shí)間3 h、溫度51 ℃、酶比例(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶，下同)1∶1，每個(gè)單因素最佳值被確定后會(huì)固定到后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果如圖1所示。

圖1 各因素對(duì)復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白產(chǎn)物的抗氧化活性的影響Fig.1 The effect of various factors on the antioxidant activity of hydrolysis products of silkworm pupa protein by compound enzyme

由圖1a可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著pH值的增大而增強(qiáng)，在7.5左右達(dá)到最大值，超過(guò)7.5以后隨著pH值的增大而減弱；由圖1b可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著固液比的減小而減弱，綜合考慮，固液比1∶10較為適宜；由圖1c可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著加酶量的增大而增強(qiáng)，在2%左右達(dá)到最大值，超過(guò)2%以后隨著加酶量的增大而減弱；由圖1d可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在3 h左右達(dá)到最大值，超過(guò)3 h以后隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱；由圖1e可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)，在60 ℃左右達(dá)到最大值，超過(guò)60 ℃以后隨著溫度的升高而減弱；由圖1f可知，水解產(chǎn)物的抗氧化活性隨著堿性蛋白酶比例的減小而增大，在酶比例為1∶1左右達(dá)到最大值，隨著堿性蛋白酶比例的繼續(xù)減小水解產(chǎn)物的抗氧化活性減弱。

由圖1結(jié)果初步確定最佳復(fù)合酶水解工藝參數(shù)分別為：pH值7.5，固液比1∶10，加酶量2%，水解時(shí)間3 h，溫度60 ℃，酶比例1∶1。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以自由基清除率為響應(yīng)值，選取pH值(A)、加酶量(B)、水解時(shí)間(C)、溫度(D)、酶比例(E)進(jìn)行5因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 The response surface experiment results of compound enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein

2.4.1 對(duì)羥基自由基清除率的分析

對(duì)羥基自由基清除率進(jìn)行了響應(yīng)面回歸模型的方差分析，見(jiàn)表4。

表4 羥基自由基清除率的響應(yīng)面回歸模型的方差分析

Tab.4 Variance analysis of the response surface regression model of scavenging rate of hydroxyl free radical

使用Design-Expert 8.0.6分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸擬合分析，得到pH值(A)、加酶量(B)、水解時(shí)間(C)、溫度(D)、酶比例(E)之間的響應(yīng)面回歸模型為：羥基自由基清除率(%)=60.12683+0.239312A+2.482313B+1.062C-0.39144D+0.306313E+0.0845AB+0.20025AC-0.20225AD-0.13125AE-0.19275BC-0.4765BD-0.3465BE+0.3215CD-0.1135CE-2.229DE-3.64263A2-7.77146B2-4.09671C2-3.31963D2-5.64029E2。

分析統(tǒng)計(jì)軟件獲得pH值、加酶量、水解時(shí)間、溫度、酶比例相互之間的響應(yīng)曲面，部分因素相互之間的響應(yīng)曲面三維圖形見(jiàn)圖2。

從表4和圖2 可以看出,B、C、DE、A2、B2、C2、D2、E2對(duì)羥基自由基清除率的影響極顯著(P<0.01)，其它各項(xiàng)對(duì)羥基自由基清除率的影響不顯著(P>0.05)，各因素對(duì)羥基自由基清除率的影響大小順序?yàn)椋杭用噶?水解時(shí)間>溫度>酶比例>pH值。該模型回歸性極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)P=0.3983，差異不顯著，說(shuō)明該模型擬合精確、可信，可用于預(yù)測(cè)、分析復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的水解產(chǎn)物對(duì)羥基自由基清除率的影響。

圖2 各因素對(duì)羥基自由基清除率的響應(yīng)曲面Fig.2 The response surface between various factors on the scavenging rate of hydroxyl radical

2.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基清除率的分析

對(duì)超氧陰離子自由基清除率進(jìn)行了響應(yīng)面回歸模型的方差分析，見(jiàn)表5。

表5 超氧陰離子自由基清除率的響應(yīng)面回歸模型的方差分析

Tab.5 Variance analysis of the response surface regression model of scavenging rate of superoxide anion free radical

使用Design-Expert 8.0.6分析統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸擬合分析，得到pH值(A)、加酶量(B)、水解時(shí)間(C)、溫度(D)、酶比例(E)之間的響應(yīng)面回歸模型為：超氧陰離子自由基清除率(%)=40.39733-1.51813A+0.884875B+1.079313C-1.4945D+0.708938E-0.707AB-0.04375AC+0.46525AD+0.772AE-0.1195BC+0.4815BD-1.076BE-0.39525CD+0.18025CE+0.215DE-3.75108A2-6.55242B2-4.25633C2-3.59108D2-2.88667E2。分析統(tǒng)計(jì)軟件獲得pH值、加酶量、水解時(shí)間、溫度、酶比例相互之間的響應(yīng)曲面，部分因素相互之間的響應(yīng)曲面三維圖形見(jiàn)圖3。

從表5和圖3可以看出，A、B、C、D、E、A2、B2、C2、D2、E2對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響極顯著(P<0.01)外，BE對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響顯著(P<0.05)，其它各項(xiàng)對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響不顯著(P>0.05)，各因素對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響大小順序?yàn)椋簆H值>溫度>水解時(shí)間>加酶量>酶比例。該模型回歸性極顯著(P<0.0001)，失擬項(xiàng)P=0.1651，差異不顯著，說(shuō)明該模型擬合精確、可信，可用于預(yù)測(cè)、分析復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的水解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響。

圖3 各因素對(duì)超氧陰離子自由基清除率的響應(yīng)曲面Fig.3 The response surface between various factors on the scavenging rate of superoxide anion free radical

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件及水解效果驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面分析和預(yù)測(cè)，得到復(fù)合酶水解蠶蛹蛋白的優(yōu)化工藝條件為：采用堿性蛋白酶+中性蛋白酶復(fù)合酶，pH值 7.47，固液比1∶10，加酶量2.1%，水解時(shí)間2.7 h，溫度59.2 ℃，酶比例(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶)1.3∶1，在該工藝條件下預(yù)測(cè)羥基自由基清除率為60.30%，超氧陰離子自由基清除率為40.78%。

為了驗(yàn)證優(yōu)化工藝條件的可靠性，進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為蛋白水解度41.73%，多肽得率33.29%，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率59.48%、超氧陰離子自由基清除率40.57%。結(jié)果顯示實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值相差不大，證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行?、可信，可用于指?dǎo)蠶蛹蛋白可控酶解制備抗氧化活性多肽。

3 結(jié)論

對(duì)蠶蛹蛋白進(jìn)行了單酶和復(fù)合酶水解實(shí)驗(yàn)，確定了可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的最佳工藝條件為：采用堿性蛋白酶+中性蛋白酶復(fù)合酶，pH值 7.47，固液比1∶10，加酶量2.1%，水解時(shí)間2.7 h，溫度59.2 ℃，酶比例(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶)1.3∶1。在此工藝條件下，蠶蛹蛋白水解度為41.73%，多肽得率為33.29%，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率為59.48%、超氧陰離子自由基清除率為40.57%。該抗氧化活性多肽生產(chǎn)工藝操作簡(jiǎn)單，條件溫和，對(duì)蠶蛹蛋白水解情況好，抗氧化活性多肽得率較高，酶解程度可控。本研究可為蠶蛹蛋白的深加工和綜合利用提供有效借鑒。

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Optimization of Controllable Enzymatic Hydrolysis Conditions for Preparation of Antioxidant Active Polypeptide from Silkworm Pupa Protein

ZUO Zhen-yu，YE Chuan

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430081，China)

Inthisstudy,usingdefattedanddecoloredsilkwormpupaproteinpowderasrawmaterials,theenzymatichydrolysisoftheproteinbydifferentsourcesofsingleenzyme(alkalineprotease,trypsin,neutralprotease,papain,pepsin)andcompoundenzymewasinvestigatedbyconsideringcomprehensiveindexofproteinhydrolysisdegree,polypeptideyield,andantioxidantactivityofhydrolysisproducttodeterminethemostsuitablesingleenzymeandcompoundenzyme.Theoptimalconditionsofpreparingantioxidantactivepolypeptidebycontrollableenzymatichydrolysisofsilkwormpupaproteinwereasfollowsbyaresponsesurfacemethodology:compoundenzymes(alkalineprotease∶neutralprotease=1.3∶1)weretheoptimalhydrolysisenzymes,silkwormpupaproteinpowderwastreatedbyultrasonic(10min,on3s,off2s),andhydrolyzedat59.2 ℃for2.7hwithpHvalue7.47,solid-liquidratio1∶10(g∶mL),enzymedosage2.1%.Undertheseconditions,theproteinhydrolysisdegreewas41.73%,thepolypeptideyieldwas33.29%,andthescavengingratesofhydroxylfreeradicalandsuperoxideanionfreeradicalofhydrolysisproductswere59.48%and40.57%,respectively.

silkwormpupaprotein;activepolypeptide;controllableenzymatichydrolysis;antioxidantactivity;hydrolysisdegree

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014CFB802)

Q 556.9

A

1672-5425(2017)01-0032-07

左振宇，葉川.可控酶解蠶蛹蛋白制備抗氧化活性多肽的研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(1)：32-38,65.