（廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心廣州511447）

二維液相色譜法同時(shí)檢測嬰幼兒乳粉中維生素A、E與D3

岑建斌，區(qū)碩俊，周朗君，李秀英

（廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心廣州511447）

建立二維高效液相色譜法同時(shí)測定嬰幼兒乳粉中的維生素A、維生素E（α-生育酚）及維生素D3三種脂溶性維生素的方法，達(dá)到快速檢測的目的。樣品經(jīng)皂化后用石油醚提取，氮?dú)獯蹈?，并用正己烷定容。維生素A、E經(jīng)NH2色譜柱分離后切換十通閥，維生素D3繼續(xù)經(jīng)Silica色譜柱分離，雙二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測。方法學(xué)結(jié)果表明，3種維生素在給定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)線性回歸系數(shù)r為0.9963～0.9995。平均加標(biāo)回收率為86.7%～99.6%，相對平均偏差RSD（n=6）為2.07%～4.11%。本方法具有操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于奶粉中3種脂溶性維生素含量的日常檢測。

十通閥；二維高效液相色譜；同時(shí)測定；脂溶性維生素

0 引言

目前嬰幼兒乳粉中的維生素A、D、E主要是視黃醇、維生素D3及α-生育酚。這三種維生素對人體均有重要的作用，一但缺乏將導(dǎo)致一系列如夜盲、骨質(zhì)疏松、易感染、癌癥等疾病[1-5]。由于嬰幼兒食物來源單一，這三種維生素在乳粉中的含量直接影響嬰幼兒的健康，故維生素A、D、E的含量意味著產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，對它們進(jìn)行監(jiān)管尤為重要[6-9]。

目前檢測維生素AE主要的方法有高效液相色譜法[10-11]、比色法[10]。而維生素D3主要是高效液相色譜法[11]。比色法雖然操作簡單，但靈敏度不夠，對樣品的富集要求高。而目前的高效液相色譜法檢測時(shí)需要使用正反相兩臺(tái)不同的儀器，耗時(shí)耗力，不適用于日常檢測[11]。本文建立正相二維液相色譜法[12-15]，簡化了維生素D3取餾分的步驟，提高了檢測效率[16-17]，該方法回收率高，靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以用于檢測維生素A、D3、E含量較低的乳粉。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1儀器與試劑

儀器，Agilent 1260高效液相色譜儀（配置二極管陣列檢測器（DAD）2臺(tái)、四元泵2臺(tái)、十通閥、1260自動(dòng)進(jìn)樣器）、IKA MS3渦旋振蕩器、KDC-170低速離心機(jī)、METTLER TOLEDO XPE 105分析天平、MILLIPORE超純水系統(tǒng)、JULABO恒溫水浴鍋、SPECORD 50 PLUS分光光度計(jì)、turbovap lv濃縮氮吹儀。

試劑，氫氧化鉀、抗壞血酸、石油醚、無水乙醇（分析純），異丙醇、環(huán)己烷、正己烷（色譜純）、視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）、維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.9%）。

1.2色譜條件

第一色譜柱，waters spherisorb?”5 μm 4.6×150mm NH2柱。

第二色譜柱，waters spherisorb?5 μm 4.6×150 mm Silica柱。

A1、B1流動(dòng)相對應(yīng)泵1，A2、B2對應(yīng)泵2，流動(dòng)相A1和A2均為異丙醇∶環(huán)己烷=2∶98，流動(dòng)相B1和B2均為正己烷。兩四元泵總流速均為1.0 mL/min，其中A1、B1、A2、B2對應(yīng)流速均為0.5 mL/min，柱溫25℃；檢測波長，維生素A 325 nm，維生素D3264 nm，維生素E 296 nm，進(jìn)樣量50 μL。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取適量的維生素A，維生素D3，維生素E標(biāo)準(zhǔn)品分別用正己烷配制成質(zhì)量濃度為50，100和10 mg/L的儲(chǔ)備液。使用分光光度計(jì)分別在波長325，264和294 nm下校正質(zhì)量濃度，校正后質(zhì)量濃度分別為50.1，100.9，10.0 mg/L。分別準(zhǔn)確取適量上述儲(chǔ)備液，用正己烷稀釋成質(zhì)量濃度分別為0，0.5，2，8，16，32 mg/L和0，20，40，30，80，100 mg/L及0，0.05，0.25，0.5，2.0，4.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4樣品的前處理

分別準(zhǔn)確稱取10 g（精確至0.001 g）嬰兒乳粉于100 mL棕色具塞比色管中，加入少量溫?zé)崴?0～60℃）溶解，冷卻至常溫定容至刻度。取10 mL乳液于50 mL膠質(zhì)離心管中。加入15 mL質(zhì)量濃度為15 g/L抗壞血酸-乙醇溶液，3 mL 55%氫氧化鉀，充入氮?dú)獗Ｗo(hù)，然后將溶液置于恒溫水浴箱中震蕩恒溫55℃皂化1 h。取出冷卻至室溫后加入15 mL石油醚渦旋震蕩1 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min離心2 min，吸取上清液石油醚層至100 mL棕色具塞比管中，重復(fù)上述提取步驟3次，合并上清液，加入40 mL純水清洗石油醚提取液，吸取上清液至50 mL試管中，然后氮吹吹至剛好干燥并立即取出。準(zhǔn)確加入1 mL正己烷溶解定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至棕色進(jìn)樣瓶，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1二維色譜流路構(gòu)建與切換時(shí)間的確定

2.1.1 閥切換時(shí)間的確定

要對十通閥進(jìn)行切換，需要先確定維生素D3在NH2柱的保留時(shí)間。在不切換十通閥的情況下，使用標(biāo)準(zhǔn)工作液測試出三種脂溶性維生素在NH2柱的出峰時(shí)間，以確定具體的閥門切換方案。維生素A，D3，E在NH2柱中的保留時(shí)間如圖1所示。由圖1可以看出，保留時(shí)間分別為14.2，9.0，3.9 min。然后通過維生素D3在NH2柱的保留時(shí)間，截取相應(yīng)時(shí)間區(qū)間切換到Silica柱。當(dāng)所有維生素D3切換至Silica柱后，十通閥切換回本來位置由檢測器1繼續(xù)檢測維生素A。由于液相色譜出峰時(shí)間會(huì)有漂移的情況發(fā)生，所以在實(shí)際應(yīng)用上，一般截取比出峰的時(shí)間區(qū)間略大0.2 min的時(shí)間范圍，閥門切換時(shí)間參考如表1所示。

2.1.2 二維色譜流路構(gòu)建

由于維生素D3在乳粉中含量較低，因此需要進(jìn)一步的分離與凈化，以減少雜質(zhì)對分析結(jié)果的影響。本方法中第一色譜柱采用NH2柱，切換至Silica正相色譜柱，兩四元泵采用相同的流動(dòng)相，具體連接方法如圖2所示。維生素A與維生素E于同一檢測器檢測，維生素D3通過另一檢測器檢測。十通閥的切換時(shí)間由維生素D3保留時(shí)間確定，切換后流路如圖3所示。

圖1 維生素A，D3，E在NH2柱的出峰情況

表1 閥門切換時(shí)間

2.2色譜柱的選擇

圖2 十通閥切換前二維液相流路示意圖

圖3 十通閥切換后二維液相流路示意圖

極性溶劑會(huì)對維生素A產(chǎn)生異構(gòu)作用[18]，本研究采用低極性溶劑正己烷和環(huán)己烷，因而采用正相色譜系統(tǒng)。其中維生素A和E在乳粉基質(zhì)下利用NH2柱分離，在相應(yīng)出峰時(shí)間中干擾較少，響應(yīng)較高，可滿足分析要求。維生素D3在基質(zhì)干擾下，無法得到峰型良好的目標(biāo)峰，需要進(jìn)一步分離?？紤]HP-Silica柱固定相含有活性羥基，活性羥基中的孤對電子可與維生素D3中的羥基和發(fā)生氫鍵作用，因而這種范德華力使正相鍵合硅膠對維生素D3有較好的保留，可以更好地使雜質(zhì)與之分離，第二色譜柱選擇Silica柱。本實(shí)驗(yàn)曾探究氰基柱與NH2柱作為一維色譜柱單獨(dú)對維生素D3的分離效果，發(fā)現(xiàn)氰基柱對維生素D3的保留較弱，4 min左右出峰，無法很好地分離雜質(zhì)，當(dāng)維生素D3進(jìn)入Silica柱后，較多雜質(zhì)進(jìn)入，造成分離不好、出現(xiàn)大量雜峰等情況。后更換為NH2柱，發(fā)現(xiàn)NH2柱對維生素D3的保留更加強(qiáng)，而且滿足維生素A與E的檢測要求，目標(biāo)物與雜質(zhì)均能得到很好的分離，維生素D3的峰型也得到改善。最后得出一維色譜柱為NH2柱，二維色譜柱為HP-Silica色譜柱的結(jié)論。具體樣品中素維生素D3色譜圖如圖4所示。

圖4 樣品中二維柱維生素D3的出峰情況

2.3樣品處理?xiàng)l件的選擇

2.3.1 不同皂化時(shí)間對回收率的影響

維生素A、D3、E屬于脂溶性維生素，需要皂化去脂，否則無法有效提取。皂化既要求時(shí)間盡可能地短，也需要讓反應(yīng)充分地進(jìn)行。選定55℃為皂化溫度，在此考察0.5，1，2，3，4 h皂化時(shí)間對回收率的影響。當(dāng)皂化時(shí)間為0.5 h，維生素A回收率較低，皂化1 h和2 h維生素A、維生素E（α-生育酚）、維生素D3回收率均較高，其中，皂化2 h的實(shí)驗(yàn)中維生素A的回收率略高于皂化1 h的實(shí)驗(yàn)，維生素D3情況相反，這是由于維生素A、E都具備耐高溫的性質(zhì)，但皂化時(shí)間在2 h內(nèi)，維生素A損失較少，表面包被被破壞及其構(gòu)型從酯型轉(zhuǎn)化為游離醇型更加充分，致使萃取效率更高。而維生素D3在皂化時(shí)間1～2 h的時(shí)間區(qū)間內(nèi)，發(fā)生少量氧化損失，導(dǎo)致回收率略低1.5%。維生素E的回收率在皂化1 h和2 h的時(shí)間內(nèi)相差不大，在皂化3 h時(shí)發(fā)現(xiàn)回收率有降低的情況發(fā)生。綜合考慮到實(shí)驗(yàn)效率，時(shí)間成本，結(jié)果等，顯然皂化時(shí)間1 h更符合要求，具體結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同皂化時(shí)間對回收率的影響

2.3.2 不同皂化溫度對回收率的影響

選用1 h皂化時(shí)間，考察25，40，55，70，85℃條件下，3種維生素的平均回收率。由于25℃和40℃溫度較低，導(dǎo)致樣品皂化不完全而各種維生素回收率相對較低，從結(jié)果看，維生素A在55，75，85均得到良好的回收率；但70℃和85℃會(huì)導(dǎo)致維生素D3與維生素E穩(wěn)定性下降，回收率降低，其中對維生素D3的影響特別明顯，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)采用55℃的條件較好，具體結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同皂化溫度對回收率的影響

2.3.3 維生素C-乙醇溶液添加量對回收率的影響

維生素C-乙醇溶液作為體系的抗氧化劑，對維生素A，D3，E有一定的保護(hù)作用，所以實(shí)驗(yàn)過程要添加一定量該溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示添加5 mL該溶液，抗氧化性能不足，致使回收率偏低，而又因?yàn)?種維生素對酸性條件比較敏感，加入過量維生素C會(huì)對回收率產(chǎn)生不良影響，維生素C-乙醇溶液添加15 mL可達(dá)到相對較高的回收率，具體結(jié)果如圖7所示。

圖7 維生素C-乙醇溶液添加量對回收率的影響

2.4線性關(guān)系和檢出限

使用儲(chǔ)備液，稀釋成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)樣，然后以檢出濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出線性相關(guān)系數(shù)r。根據(jù)儀器的具體情況，以信噪比（S/N）三倍時(shí)的響應(yīng)濃度作為儀器檢出限，信噪比十倍時(shí)響應(yīng)濃度為定量限，詳細(xì)結(jié)果如表2所示。定量限為0.06～3.00 mg/kg可以滿足日常乳粉檢測的定量需求。

表2 3種脂溶性維生素的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）和方法檢出限

2.5回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

使用市售嬰幼兒乳粉進(jìn)行樣品實(shí)驗(yàn)，首先測量出其維生素A，D3，E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。加標(biāo)量分別為本底0.5，1，2倍三水平，然后再采用本方法繼續(xù)進(jìn)行檢測（具體結(jié)果參照表3）。結(jié)果表明平均加標(biāo)回收率為86.7%～99.6%，相對平均偏差RSD（n=6）為2.07%～4.11%，表明方法精密度良好。

2.6 F值與t值檢驗(yàn)

對某市售嬰幼兒乳粉進(jìn)行方法對比分別用GB5413.9與本方法進(jìn)行各6次試驗(yàn)，進(jìn)行比對，以驗(yàn)證本方法是否存在顯著性差異。計(jì)算得出維生素A、維生素D3、維生素E的F值分別為0.015，0.506，0.475，均小于F0.05，5，5=5.05說明兩種方法精密度間不存在顯著差異。t值分別為2.122，0.991，和0.571。均小于t0.05，10=2.23。兩種方法測定結(jié)果無顯著性差異。

表3 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6） μg/100g

3 結(jié)論

本研究采用皂化反應(yīng)法，過程中加入適量維生素C抗氧化，然后采用石油醚對脂溶性維生素A，D，E進(jìn)行提??；最后采用十通閥構(gòu)建流路，二維液相色譜凈化分離維生素D3，讓3種物質(zhì)能在一臺(tái)液相色譜儀進(jìn)行檢測。本方法回收率高，靈敏度高，重復(fù)性好，操作方便，效率高，方法精密度與測定結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)無顯著差異，適用于嬰幼兒乳粉中維生素A、D3、E的日常檢測。

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Simultaneous determination of Vitamin A，α-Tocopherol and Vitamin D3in in?fant milk powder with two-dimensional high performance liquid chromatography

CEN Jianbin，OU Shuojun，ZHOU Langjun，LI Xiuying
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，National Centre for Quality Supervison and Testing of Processed Food（Guangzhou），Guangzhou Guangdong 511447,China）

A method of two-dimensional high performance liquid chromatography（2D-HPLC）have been created for the determination of fat-soluble vitamins（Vitamin A，Vitamin E and Vitamin D3）in infant milk powder.The samples were saponified and extracted with petroleum ether successively.The extract was blew with nitrogen until dried and dissolved with n-hexane to a constant volume.The ten-way valve was switched after Vitamin A and Vitamin E were separated at the amino column，which Vitamin D3can be separated at the Silica gel column.Both columns were coupled with a diode-array detector respectively.The methodology results showed that three fat-soluble vitamins exhibited a good linear relationship in the certain range（Linear Regression Coefficient：0.9963～0.9993）.The recoveries were in the range of 86.7%～99.6%and RSD（n=6）was ranged from 2.07%to 4.11%.The method is simple，high sensitivity and good reproducibility，which is suitable for routine testing of Vitamin A，Vitamin E and Vitamin D3in the infant milk powder.

Ten-way valve；2D-HPLC；simultaneous determination；fat-soluble vitamins

TS252.7

A

1001-2230（2017）02-0043-04

2016-09-21

岑建斌（1989-），男，學(xué)士，主要從事食品的檢測和研究工作。