馬春驥，張曉光，裴秀英，王燕蓉

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與制藥技術(shù)系,寧夏銀川 750021；2.寧夏醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所,寧夏銀川 750004；3.河南省漯河市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，河南漯河 462300；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004)

FSH體外干預(yù)小鼠卵巢后DGE表達(dá)譜的建立及初步分析

馬春驥1，2，張曉光3，裴秀英2，4，王燕蓉4

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與制藥技術(shù)系,寧夏銀川 750021；2.寧夏醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所,寧夏銀川 750004；3.河南省漯河市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院，河南漯河 462300；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004)

本研究利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，構(gòu)建FSH體外干預(yù)小鼠卵巢12 h后的DGE差異基因表達(dá)譜，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和Pathway信號通路分析。發(fā)現(xiàn)FSH干預(yù)培養(yǎng)12 h組(FA)和無FSH干預(yù)培養(yǎng)12 h組(NA)之間存在顯著差異基因256個(gè)，其中上調(diào)基因34個(gè)，下調(diào)基因222個(gè)。對差異表達(dá)基因功能注釋分析表明，在體外干預(yù)培養(yǎng)小鼠卵巢的過程中，F(xiàn)SH主要對小鼠卵巢生殖相關(guān)的細(xì)胞元件生成、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、核糖體生成、性腺發(fā)育、雌性性腺發(fā)育等GO功能類基因有一定影響，并通過趨化因子、ErbB、促性腺激素釋放素、粘著斑、血管內(nèi)皮生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白因子等信號通路干預(yù)小鼠卵巢體外培養(yǎng)。

小鼠；卵巢；FSH；數(shù)字基因表達(dá)譜

卵巢深低溫凍存再移植技術(shù)將有可能幫助女性恢復(fù)或延長生育能力，特別是對于女性癌癥患者，在治療腫瘤前可利用該技術(shù)體外保存其生殖細(xì)胞。但是體外凍存和移植過程中會(huì)對卵巢造成一定的損傷。Aubard和張皓云等人在移植卵巢組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，移植造成了一半以上的原始卵泡的損失[1-2]。對于雌性哺乳動(dòng)物，母體卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH)是一類重要的性激素，其與生殖系統(tǒng)密切相關(guān)。有研究表明，若在卵巢組織移植過程輔以FSH，可最大限度地提高卵泡和卵母細(xì)胞的直徑，提高次級卵泡的百分比，說明FSH對卵泡的生長發(fā)育有重要作用[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，將體外培養(yǎng)的小鼠卵巢組織移植回體內(nèi)時(shí)，經(jīng)體外FSH短暫干預(yù)培養(yǎng)的小鼠卵巢組織在血流重建時(shí)間和卵泡閉鎖抑制等方面，均要優(yōu)于未經(jīng)FSH干預(yù)組[5]，但尚不清楚其作用機(jī)理。

作為新一代高通量測序技術(shù)，數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital Gene Expression Tag Profiling，DGE)可針對某一物種特定組織的特定狀態(tài)下mRNA的表達(dá)情況，進(jìn)行全面、精準(zhǔn)、快速的檢測，獲得物種特定組織、特定狀態(tài)的基因表達(dá)圖譜，從而在基因表達(dá)水平進(jìn)行數(shù)字化分析。本研究利用DGE技術(shù)，對體外FSH干預(yù)的小鼠卵巢組織構(gòu)建其數(shù)字基因表達(dá)譜，初步分析其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級的ICR品系雌性小白鼠，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性小白鼠體重(20±2)g。主要試劑為卵泡刺激素(FSH)：注射用重組人卵泡刺激素(果納芬)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM/F12(5 g)、鏈霉素(0.1 g)、Hepes(2.38 g)、NaHCO3(2.388 g)、二甲基亞砜(10 mL)、青霉素(10萬IU)。用NaHCO3將基礎(chǔ)培養(yǎng)液pH值調(diào)至7.2～7.4，將調(diào)制好的基礎(chǔ)培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm的微孔濾器過濾除菌備用。在卵巢體外培養(yǎng)過程中，F(xiàn)SH干預(yù)組為在基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)添加FSH至終濃度達(dá)到0.3 IU·mL-1?；A(chǔ)培養(yǎng)液在使用前加入10 % 小牛血清。

1.2.2 卵巢的獲取

通過觀察小鼠動(dòng)情周期陰道涂片，取其雙側(cè)卵巢，將每只小鼠的兩個(gè)卵巢隨機(jī)分成FA和NA組。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)研究目的，將100只雌性小鼠的200枚卵巢分為FA和NA 兩組(FA組為0.3 IU·mL-1FSH 體外干預(yù)培養(yǎng)12 h，NA組為無FSH體外干預(yù)培養(yǎng)12 h)。

1.2.4 總RNA提取與純化

利用TRizol提取法提取卵巢組織總RNA，并進(jìn)行純化。使用生物分析儀檢測總RNA的濃度和純度，檢測前RNA均經(jīng)過DNaseI處理。

1.2.5 RNA測序樣品處理

利用Oligo(dT)磁珠取6 μg待測樣本總RNA，對其mRNA進(jìn)行吸附和純化。純化后的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。用內(nèi)切酶NlaIII(識別位點(diǎn)為CATG)處理雙鏈cDNA，再利用磁珠對其純化，并在其5’末端連上測序所需的接頭1。用MmeI內(nèi)切酶(識別位點(diǎn)為CATG，切割位點(diǎn)為識別位點(diǎn)下游17 bp處)處理測序樣品，產(chǎn)生大量帶有接頭1的標(biāo)簽序列和帶有磁珠的序列。再利用磁珠吸附沉淀去除3’片段后，剩余即為帶有接頭1的測序樣品，在其3’末端連上接頭2，獲得5’和3’端連有不同接頭的21 bp標(biāo)簽序列庫，純化后上機(jī)測序(圖1)。

圖1 測序標(biāo)簽制備的原理和步驟

1.2.6 測序數(shù)據(jù)的獲取

因測序所得到的原始數(shù)據(jù)含有3’端接頭序列和部分低質(zhì)量數(shù)據(jù)，需對其行處理。去除3’端接頭、空片段、低拷貝片段和長度過大或過小的序列，最終得到干凈的測序數(shù)據(jù)。

1.3 測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

對全部干凈的測序數(shù)據(jù)與GenBank小鼠基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并進(jìn)行基因注釋。此外，為了獲得測序樣本中基因表達(dá)量，以保證基因表達(dá)水平更加準(zhǔn)確，需對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化方法為：每個(gè)基因包含的原始干凈的標(biāo)簽數(shù)/該樣本中總干凈的標(biāo)簽數(shù)×1 000 000。

通過對差異基因進(jìn)行P-value多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，篩選FSH干預(yù)培養(yǎng)的小鼠卵巢差異基因(FDR≤0.001，差異倍數(shù)為2倍以上)。利用Cluster軟件，對FA和NA樣本中差異基因表達(dá)模式進(jìn)行聚類分析。

對FA和NA樣本中差異表達(dá)基因分別進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能顯著性富集分析和Pathway顯著性富集分析，以明確差異表達(dá)基因在分子生物學(xué)功能(molecular function)、所在細(xì)胞中的位置(cellular component)、參與行使的生物進(jìn)程(biological process)和參與主要的生化代謝途徑和信號傳導(dǎo)途徑中的作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取與純化

對FA和NA樣本卵巢組織總RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測，RNA完整指數(shù)RIN>=7.0，28S/18S>0.7，即本實(shí)驗(yàn)樣品可用，見圖2。

圖2 總RNA產(chǎn)物檢測圖譜注：F為FSH干預(yù)培養(yǎng)小鼠卵巢；N為無FSH干預(yù)培養(yǎng)小鼠卵巢

2.2 質(zhì)量分析

2.2.1 測序質(zhì)量評估

測序質(zhì)量評估表明，在NA和FA樣本中，干凈的數(shù)據(jù)總量占比分別達(dá)到93.59%和91.74%，干凈的數(shù)據(jù)種類數(shù)占比分別達(dá)到39.29%和33.99%，說明測序標(biāo)簽測序總量達(dá)標(biāo)，測序質(zhì)量很高，有效標(biāo)簽覆蓋率足夠后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，測序信息可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析，具體結(jié)果見圖3。

圖3 測序質(zhì)量分析圖

2.2.2 測序飽和度分析

隨著測序進(jìn)程的推進(jìn)，測序量也隨之增加。從圖4可以看出，無論是NA組還是FA組，基因數(shù)在測序數(shù)據(jù)量達(dá)到2 M時(shí)均趨于飽和。

圖4 樣本飽和度分析圖

2.2.3 干凈標(biāo)簽拷貝數(shù)分布統(tǒng)計(jì)

通過對干凈標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以判斷其相應(yīng)基因的表達(dá)量，且可以從整體上評估數(shù)據(jù)的可靠性。本研究結(jié)果表明，在兩組樣本中，拷貝數(shù)大于100的高表達(dá)標(biāo)簽種類數(shù)雖然很少(占比分別為3.02%和2.79%)，但表達(dá)量都超過了62%；而拷貝數(shù)小于5的標(biāo)簽雖然表達(dá)量小(占比分別為7.86%和8.46%)，但種類數(shù)上非常豐富，分別占mRNA總數(shù)的63.61%和67.05%，說明不同基因的mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)是不一致的，除少量基因高表達(dá)外，大多數(shù)基因在mRNA的表達(dá)水平都很低(圖5)。

圖5 Clean Tags拷貝數(shù)分布統(tǒng)計(jì)圖

2.3 差異基因的表達(dá)分析

以FDR≤0.01且差異基因表達(dá)量倍數(shù)在2倍及以上為篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)FA組與NA組的小鼠卵巢存在顯著的基因差異，共有差異基因256個(gè)，其中高表達(dá)差異基因34個(gè)，低表達(dá)差異基因222個(gè)。

2.4 差異表達(dá)基因GO功能顯著性富集分析

對FSH體外干預(yù)和無FSH干預(yù)的小鼠卵巢培養(yǎng)12 h表達(dá)差異基因進(jìn)行GO功能分類。結(jié)果顯示FSH干預(yù)后，在細(xì)胞組分Ontology中有196個(gè)基因差異表達(dá)，顯著富集在細(xì)胞內(nèi)(intracellular part)、膜結(jié)合細(xì)胞器(membrane-bounded organelle)等6個(gè)GO-term中。在分子功能Ontology中有193個(gè)基因差異表達(dá)，雖然沒有顯著富集，但大部分基因主要集中于結(jié)合功能的基因上。在生物學(xué)過程Ontology中，有188個(gè)差異基因表達(dá)，雖然也沒有顯著富集，差異基因主要集中在核糖核蛋白復(fù)合(ribonucleoprotein complex biogenesis)、細(xì)胞元件的生成(cellular component biogenesis at cellular level)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育(reproductive structure development)、核糖體生成(ribosome biogenesis)、性腺發(fā)育(gonad development)、雌性性腺發(fā)育(female gonad development)等過程中。圖6僅以P-value<0.05為閾值定義差異表達(dá)基因中顯著富集的GO-term。

圖6 FSH干預(yù)差異表達(dá)基因GO功能分類

2.5 差異表達(dá)基因信號通路(Pathway)顯著性富集分析

對FA組和NA組小鼠卵巢201個(gè)差異基因進(jìn)行Pathway分析，將P-value<0.05的信號通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的通路。以此為標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)SH體外干預(yù)小鼠卵巢差異基因主要集中在10個(gè)信號通路中，分別為：趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、促性腺激素釋放素信號通路(GnRH signaling pathway)、粘著斑信號通路(Focal adhesion signaling pathway)、Fc epsilon RI signaling pathway、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白因子信號通路(Neurotrophin signaling pathway)、半乳糖代謝信號通路(Galactose melabolism signaling pathway)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤信號通路(Glioma signaling pathway)和間隙連接信號通路(Gap junction signaling pathway)(表1)。

表1 NA vs FA的Pathway顯著富集列表(Top 10)

3 討論

目前，可通過DNA-RNA雜交、差異顯示、表達(dá)序列標(biāo)簽等技術(shù)對生物在不同生長發(fā)育階段和處理?xiàng)l件下的差異基因進(jìn)行比較，并獲得基因表達(dá)圖譜，但由于此類技術(shù)存在一定的缺陷，以至于獲得的基因表達(dá)模式信息有限，不能對差異基因進(jìn)行定量研究。近年來，研究人員多采用基因芯片技術(shù)研究高通量基因差異表達(dá)，但該技術(shù)需事先制備大量已知cDNA或寡核苷酸序列分子探針，再采用特殊方法固定或原位合成在支持物上，對選定的基因進(jìn)行表達(dá)模式分析[6]。本實(shí)驗(yàn)采用DGE技術(shù)具有高通量和高靈敏性的優(yōu)勢，不需要獲得目標(biāo)基因序列，可更準(zhǔn)確、全面、高效地從全轉(zhuǎn)錄組水平反映生物體在生長發(fā)育過程中基因表達(dá)變化情況[7-8]。在本研究中，對照組和實(shí)驗(yàn)組測序樣本量均達(dá)2 M飽和狀態(tài)，通過樣本質(zhì)量分析和拷貝數(shù)分布統(tǒng)計(jì)，均表明測序樣本信息充足、精確；但是，因基因組序列信息不足，對基因注釋及差異表達(dá)基因的功能注釋有一定影響，限制了表達(dá)譜數(shù)據(jù)的深入發(fā)掘和全面分析。

作為天然卵泡存活因子，F(xiàn)SH可影響女性卵巢的生殖和內(nèi)分泌功能[9]。在卵巢體外玻璃化凍存過程中，因低溫凍存會(huì)對卵巢造成一定損傷，已有研究員人員通過加入FSH以降低卵巢凍存損傷。陳杰等[10]研究發(fā)現(xiàn)，給不同時(shí)段的玻璃化凍存卵巢添加FSH，添加FSH的卵巢中含有的正常卵泡要顯著高于不添加FSH的卵巢。除此之外，Magalhes等[3]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)卵巢組織時(shí)，在FSH添加組中，卵泡和卵母細(xì)胞的直徑以及次級卵泡的百分比都比不添加FSH組的卵巢要高，說明FSH對卵泡的生長發(fā)育有極其重要的作用，但尚不清楚FSH作用卵巢的機(jī)理。

在本研究中值得注意的是，差異基因在趨化因子信號通路和粘著斑信號通路相對更為顯著富集。趨化因子在機(jī)體的免疫過程中發(fā)揮著重要作用，其趨使白細(xì)胞等免疫細(xì)胞在各循環(huán)系統(tǒng)和組織間游走并活化，清除感染源，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。除此之外，趨化因子還對腫瘤生長的調(diào)節(jié)、移植免疫排斥、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面起著重要作用。同時(shí)，相當(dāng)一部分的趨化因子還是細(xì)胞生長因子，促使血管生成或參與胚胎期免疫系統(tǒng)的形成[11-13]。本研究中，趨化因子信號通路富集了12個(gè)差異基因，我們推測體外培養(yǎng)小鼠卵巢是一種缺血缺氧的過程，F(xiàn)SH通過該信號通路參與了卵巢的血管生成與血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗凋亡。

4 結(jié)論

本研究對體外FSH干預(yù)培養(yǎng)12 h的小鼠卵巢差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)差異基因在Gene Ontology和Pathway上顯著富集，說明FSH參與卵巢生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、性腺發(fā)育、雌性性腺發(fā)育和細(xì)胞內(nèi)核糖體生成等生物學(xué)發(fā)育過程，并通過趨化因子信號通路、ErbB信號通路、促性腺激素釋放素信號通路、粘著斑通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白因子信號通路等體外干預(yù)小鼠卵巢，為FSH應(yīng)用于抗卵巢玻璃化凍存損傷提拱了一定的理論支持。

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The Construction and Basic Analysis of DGE About Mouse Ovarian Intervened by FSH in Vitro

MA Chun-ji1,2,ZHANG Xiao-guang3,PEI Xiu-ying2,4,WANG Yan-rong4

(1. Department of Biology and Pharmaceutical Technology, Ningxia Polytechnic College, Yinchuan Ningxia 750021,China; 2.Ningxia Institute of Med. Sciences, Yinchuan Ningxia 750004, China; 3.The Second Affiliated Hospital of Henan Luohe Medical College,Luohe Henan 462300,China; 4. Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education, Ningxia Medical University,Yinchuan Ningxia 750004,China)

Using technology of digital gene expression tag profiling to construct the gene expression profile of mouse ovarian intervened in vitro by FSH, and analyze the expression of differential genes. The estrum mouse ovarian were divided into 2 groups, one cultured with FSH 12 hours(FA), the other cultured without FSH 12 hours(NA).Then analyze the Gene Oncology and Pathway. There are 256 differential genes between FA and NA，including 34 up-regulated genes and 222 down-regulated genes. The Gene ontology analysis of differential genes demonstrate that FSH has effect on GO functional genes about cellular component biogenesis at cellular level, reproductive structure development, ribosome biogenesis, gonad development, female gonad development and these genes have taken part in signaling pathways including Chemokine,ErbB, GnRH, Focal adhesion,Fc epsilon RI, VEGF, Neurotrophin when mouse ovarian intervened by FSH in vitro.

mouse;ovary;FSH;DGE

2016-09-01

寧夏回族自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目“小鼠卵巢組織特異性啟動(dòng)子OSP1和DHEA基因真核表達(dá)載體的建立及活性研究”(NZ12285)；寧夏科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“促性腺激素干預(yù)移值卵巢基因表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究”(寧科計(jì)字 [2012]17)。

馬春驥(1983- )，男，講師，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

王燕蓉(1957- )，女，教授，博士生導(dǎo)師，從事生殖醫(yī)學(xué)研究。

Q954.3

A

2095-7602(2017)02-0059-07