黃斐

（許昌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南許昌461000）

不同原料厭氧發(fā)酵及其微生物種群的分析

黃斐

（許昌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南許昌461000）

文章從生物質(zhì)能源制備的厭氧發(fā)酵原理出發(fā)，依據(jù)厭氧發(fā)酵的原理，對豬糞、雞糞、牛糞及秸稈為原料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用DGGE法進(jìn)行微生物種群結(jié)構(gòu)差異分析，有利于為不同原料制取生物質(zhì)能源，提高能源產(chǎn)出效率提供科學(xué)依據(jù)。

厭氧發(fā)酵；微生物種群；生物多樣性

我國每年產(chǎn)生超過8億噸的秸稈和38億噸以上的禽畜糞污，大量的廢棄物閑置堆積甚至焚燒，造成環(huán)境生物污染，危害人畜健康。利用厭氧發(fā)酵原理制取生物質(zhì)能源沼氣將解決這一問題。

1 厭氧發(fā)酵的原理

厭氧發(fā)酵的過程分為四個(gè)階段：①水解階段。秸稈、糞便屬于有機(jī)大分子碳水化合物，難以直接被微生物吸收利用。需要通過微生物分泌胞外酶將大分子水解為溶于水的小分子化合物；②發(fā)酵階段。有機(jī)化合物作為電子受體和供體進(jìn)行生物降解的過程就是發(fā)酵。水解后，小分子化合物被發(fā)酵類細(xì)菌吸收后形成包括揮發(fā)性脂肪酸在內(nèi)的末端產(chǎn)物后,一部分被細(xì)菌自身利用，另一部分繼續(xù)分解轉(zhuǎn)化；③產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段。未被發(fā)酵類細(xì)菌利用末端產(chǎn)物在專性厭氧產(chǎn)氫細(xì)菌的作用下，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成乙酸類、二氧化碳和氫氣；④甲烷化階段。在分解類產(chǎn)甲烷菌的作用下，將乙酸進(jìn)行分解，生成二氧化碳和甲烷。另一部分氧化類產(chǎn)甲烷菌對分解產(chǎn)生的二氧化碳進(jìn)行氧化還原生成甲烷。

2 不同原料厭氧發(fā)酵微生物種群的分析

2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

選取本地水稻秸稈，按照厭氧發(fā)酵的制備標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行粉碎備用。分別在禽畜養(yǎng)殖場選取新鮮的雞糞、牛糞、豬糞，去除雜質(zhì)放置在實(shí)驗(yàn)用冷藏柜進(jìn)行保存?zhèn)溆?。預(yù)先培養(yǎng)含有沼氣細(xì)菌的培養(yǎng)物作為接種物，以提升沼氣發(fā)酵的啟動(dòng)速度。按照實(shí)驗(yàn)原料進(jìn)行分組，選用CSTR(有效容積5L)在保持溫度為35℃±0.5℃的條件下保持總固體濃度為6%，水力停留30天。每日根據(jù)物料的性質(zhì)、結(jié)合有機(jī)負(fù)荷率，在相同時(shí)刻按總進(jìn)料150g，分別控制四組進(jìn)料量。進(jìn)料前后分別攪拌20min,并測定甲烷的產(chǎn)量及濃度，在發(fā)酵的第3、9、21、27d分別取樣于-20℃實(shí)驗(yàn)用冷凍柜保存。

2.2 分析方法

DNA采用MP bio土壤基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，根據(jù)微量紫外可見分光光度計(jì)測量DNA的濃度和純度。保持蛋白質(zhì)純度比A260/A280在1.9±0.1時(shí)，繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、變性梯度凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。選擇對應(yīng)細(xì)菌V3區(qū)域和古菌區(qū)域選擇518R/341F/109F作為引物。在518R的5’端增加GC夾，用以提升DGGE的分辨效果。通過DGGE后得到的指紋圖譜,每一個(gè)條帶代表某個(gè)微生物優(yōu)勢菌群,經(jīng)測序和序列比對,從而得出此優(yōu)勢菌群的種類。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

（1）甲烷產(chǎn)量及甲烷濃度。四種原料的甲烷產(chǎn)量以豬糞的產(chǎn)量最高，牛糞最低。牛糞、豬糞、雞糞、秸稈的甲烷產(chǎn)量最高峰分別出現(xiàn)在第1、23、24、28天。牛糞的甲烷產(chǎn)量低的主要原因可能與飼養(yǎng)過程中牛服用抗生素有關(guān)。而秸稈則是含有大量纖維素、木質(zhì)素,延緩講解速度，使得厭氧發(fā)酵在第一階段水解產(chǎn)生限速，進(jìn)而延緩了整個(gè)厭氧發(fā)酵周期。當(dāng)甲烷濃度達(dá)到50%及以上時(shí)，甲烷化反應(yīng)占據(jù)明顯優(yōu)勢。濃度與產(chǎn)量相同，表現(xiàn)出豬糞最高、牛糞最低，濃度與產(chǎn)量基本呈一致變化。

（2）細(xì)菌、古菌的DGGE分析。細(xì)菌DGGE分析：厭氧發(fā)酵初期細(xì)菌各微生物的群落比較穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過半時(shí)，生物菌群發(fā)生了明顯的變化，新增了多條條帶，前15天表現(xiàn)的優(yōu)勢條帶逐漸弱化，顏色變淺。豬糞的圖譜在整個(gè)過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的特性，而牛糞的條帶從數(shù)目、顏色深淺方面均呈弱勢。選取11個(gè)條帶進(jìn)行切膠克隆，并完成測序和對比。發(fā)現(xiàn)含有大量不可培養(yǎng)的細(xì)菌種類，如梭菌屬、抑桿菌屬等，所列的兩類菌群在厭氧發(fā)酵的第三階段發(fā)揮了重要作用，在秸稈的發(fā)酵過程中，厚壁菌門、變形菌門與擬桿菌門為優(yōu)勢種群。根據(jù)Shannon-Wiener指數(shù)(H)判斷細(xì)菌菌群的多樣性指數(shù)，雞糞細(xì)菌多樣性指數(shù)最高，保持在3.59～3.73。

古菌菌DGGE分析：厭氧發(fā)酵的初期，古菌各微生物厭氧發(fā)酵群落變化中，雞糞的周期相似性差異比較明顯，豬糞則結(jié)構(gòu)相似。牛糞的各菌群聚在不同分支上，處于不斷調(diào)整的過程中。選擇其中6條條帶進(jìn)行切膠克隆，并完成測序和對比。發(fā)現(xiàn)含有包括古菌甲烷鬃菌屬、甲烷八疊球菌屬等不可培養(yǎng)古菌群。甲烷八疊球菌屬屬于優(yōu)勢微生物，產(chǎn)生大量的甲烷氣體。判斷古菌菌群的多樣性指數(shù)，雞糞古菌多樣性指數(shù)最高，可達(dá)3.55。

3 結(jié)語

對不同原料厭氧發(fā)酵所產(chǎn)出的甲烷產(chǎn)量、濃度以及微生物種群多樣性進(jìn)行分析，有利于對甲烷生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化，調(diào)整產(chǎn)氣效率。根據(jù)文章所設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，可以看出在甲烷產(chǎn)氣的過程中，以雞糞的菌群多樣性最佳，但是豬糞的菌群發(fā)展比較穩(wěn)定，產(chǎn)氣數(shù)量及濃度最高。

［1］杜婷婷,云斯寧,朱江,等.生物質(zhì)廢棄物厭氧發(fā)酵的研究進(jìn)展［J］.中國沼氣，2016，34（2）：46-52.

［2］李海紅，巴琦玥，閆志英，等.不同原料厭氧發(fā)酵及其微生物種群的研究［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2015，35（5）：1449-1457.

黃斐（1983-），男，河南許昌人，大學(xué)本科，助教，主要研究方向：微生物、發(fā)酵食品。