韓曉磊 顧益 潘林煒 沙永良 徐建榮 韓曜平

摘要：基于AFLP分子標記技術對太湖流域中華鱉花鱉群體和普通群體進行了遺傳多樣性分析。結果表明，用6對引物對2個群體52個中華鱉個體進行檢測，共獲得335個位點，其中多態(tài)位點88個，平均多態(tài)位點比例為 26.27%。普通群體和花鱉群體的Shannons指數(shù)分別為0.377 9、0.229 2，Neis指數(shù)分別為0.257 3、0.151 2，顯示2個群體遺傳多樣性處于同一水平；中華鱉花鱉群體和普通群體的種間遺傳相似度為0.948 3，遺傳距離為0.531；通過UPGMA法對2個群體進行聚類分析顯示，兩者基本能夠分別聚類，產生了一定的遺傳趨異；太湖流域2個群體中華鱉的遺傳多樣性相對貧乏，花鱉群體與普通群體產生了一定程度的遺傳分化，可能分屬于不同的亞種群。

關鍵詞：中華鱉；AFLP；遺傳多樣性；遺傳分化

中圖分類號： Q959.6+3；S917文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0101-03

收稿日期：2016-07-16

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2013349）。

作者簡介：韓曉磊（1981—），男，河北邯鄲人，碩士，實驗師，主要從事淡水水生生物學研究。E-mail：hanxiaolei0724@163.com。

通信作者：韓曜平，博士，教授，主要從事水產品生態(tài)養(yǎng)殖技術研究與示范推廣。E-mail：975683768@qq.com。

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術具有多態(tài)性豐富、顯性表達、無復等位效應、靈敏度高、快速高效等優(yōu)點，可在較短時間內掌握大量遺傳信息，已被廣泛應用于水生動物遺傳多樣性分析、種質鑒定、遺傳連鎖圖譜的構建及系統(tǒng)分類等方面[1-3]。中華鱉（Pelodiscus sinensis）隸屬于爬行綱（Reptilia）、龜鱉目（Testudoformes）、鱉科（Trionychidae），別稱甲魚、團魚、王八等。中華鱉在我國分布廣泛，除西藏、青海外的其他各?。ㄊ小^(qū)）均有發(fā)現(xiàn)，長江流域和華南地區(qū)分布較多[4-5]。太湖花鱉屬于中華鱉的地方特色品種，主要生活在長江中下游特別是太湖流域，因其背上有對稱的黑色小圓花點，在野生環(huán)境中身體油綠，裙邊寬厚，腹部有灰黑色塊狀花斑，故此得名。太湖花鱉野性十足，具有生長快、色澤艷、肉質好等特點，并因其獨特的風味和較高的營養(yǎng)價值深受消費者喜愛。江浙地區(qū)廣泛養(yǎng)殖太湖花鱉，市場前景良好。研究顯示，中華鱉還沒有明確的亞種分類，但卻存在一些不同的地理群體，其中太湖花鱉的分類地位也沒有明確論斷[6]。本研究利用AFLP分子標記技術對太湖流域中華鱉花鱉群體和普通群體進行遺傳多樣性分析，判斷2個群體是否有遺傳分化，以期為太湖流域中華鱉不同群體間的種質鑒定和分類地位提供理論支持。

1材料與方法

1.1材料

2個中華鱉群體樣品采集于2014年5—10月期間，其中花鱉群體采集于太湖流域的江蘇省太倉地區(qū)（簡稱T，野生群體，圖1），普通群體采集于太湖流域的江蘇省常州地區(qū)（簡稱C，野生群體，圖2）。以中華鱉腿部肌肉組織為材料，于無水乙醇中-20 ℃保存?zhèn)溆?，分別取30尾T群體、22尾C群體用于AFLP分析。

1.2DNA提取

中華鱉基因組DNA的提取參照韓曉磊等的方法[7]。用分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測定基因組DNA的濃度，并通過凝膠成相系統(tǒng)（UVP Biospectrum 410）檢測DNA的完整性，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3AFLP分析

參照韓曉磊等的方法[7]構建AFLP圖譜，引物、人工接頭由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，選擇性擴增使用了3種EcoRⅠ引物、3種MseⅠ引物共9個引物組合，接頭序列、預擴增引物序列、選擇性引物序列見表1。根據預試驗結果，從擴增帶數(shù)目適中、多態(tài)性高的引物組合中選取了E38M51、E38M54、E42M51、E42M54、E44M48、E44M51等6組引物組合。擴增產物在4.5%聚丙烯酰胺凝膠上進行60 W恒功率高壓電泳，對電泳結果進行銀染檢測。

1.4數(shù)據分析

將電泳圖譜中同一位置上有無AFLP條帶情況進行統(tǒng)計，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，得出“0，1”原始數(shù)據矩陣。對AFLP數(shù)據進行分析統(tǒng)計的遺傳學參數(shù)主要如下。

顯性基因型頻率Pd計算公式為：

[JZ（]Pd=ni/n；[JZ）][JY]（1）

式中：ni為位點i上有帶的個體數(shù)，n為總個體數(shù)。

多態(tài)位點比率P計算公式為：

[JZ（]P=多態(tài)位點數(shù)/位點總數(shù)×100%。[JZ）][JY]（2）

遺傳相似系數(shù)Sxy計算公式為：

[JZ（]Sxy=2Nxy/（Nx+Ny）；[JZ）][JY]（3）

式中：Nxy是個體x和個體y共有位點數(shù)；Nx、Ny分別是個體x和個體y總位點數(shù)。

遺傳距離D計算公式為：

[JZ（]D=1-S；[JZ）][JY]（4）

式中：S為相似系數(shù)。

利用POPGEN 32軟件計算遺傳相似度和遺傳距離等，利用MEGA 3.0軟件構建UPGMA系統(tǒng)樹。

2結果與分析

2.1AFLP擴增結果

由表2可見，經篩選，用6對引物組合對T、C 2個中華鱉群體總計52個樣品DNA進行了AFLP擴增，選取100～2 000 bp 的清晰條帶，共計335條，以上片段中多態(tài)性條帶為88條，多態(tài)位點比例為26.27%。不同引物組合所擴增的位點數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)相差不大，擴增條帶數(shù)為50～59條，多態(tài)性條帶為12～16條，多態(tài)位點比例為24.00%～28.57%。其中在C、T 2個群體中分別擴增出76、75條擴增條帶，平均多態(tài)位點比例分別為22.69%、22.39%。圖3為引物E44M48在太湖流域中華鱉2個群體中的擴增圖譜。

2.22個中華鱉群體的遺傳多樣性和遺傳距離分析

由表3可見，中華鱉花鱉群體和普通群體的Shannons指數(shù)分別為0.377 9、0.229 2，Neis指數(shù)分別為0.257 3、0.151 2，可見花鱉群體的遺傳多樣性略低于普通群體，2個群體遺傳多樣性處于同一水平。花鱉群體、普通群體的種間遺傳相似度為0.948 3，遺傳距離為0.053 1。

2.3聚類分析

通過Popgen 32軟件用UPGMA方法構建了52個太湖流域中華鱉個體的系統(tǒng)樹（圖4）。中華鱉普通群體、花鱉群體基本能夠分別聚類，出現(xiàn)了明顯的遺傳分化。

3結論與討論

3.1遺傳多樣性分析

本研究選用6對引物對太湖流域中華鱉花鱉群體和普通群體共計52個個體進行AFLP檢測，共獲得335個位點，其中多態(tài)位點88個，平均多態(tài)位點比例為26.27%，與已報道的其他水生動物AFLP數(shù)據[7-10]對比發(fā)現(xiàn)，太湖流域中華鱉群體的遺傳多樣性處于較低水平。通過分析Shannons指數(shù)、Neis指數(shù)，得出了同樣的結論。中華鱉花鱉群體、普通群體的平均多態(tài)位點比例、Shannons指數(shù)、Neis指數(shù)均無明顯差異，判定兩者遺傳多樣性處于同一水平。

自古以來中華鱉就是名貴的食物和藥材，近代中華鱉的人工養(yǎng)殖發(fā)展非常迅速[11]。隨之而來的是野生甲魚被捕獲用于食用與養(yǎng)殖，導致了自然種群混雜，群體多樣性不斷降低，中華鱉種質嚴重退化，野外個體數(shù)量不斷減少[12]。日前世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）發(fā)布的最新版全球瀕危物種紅色名錄，已將中華鱉列入瀕危物種名單[13]?；谝陨锨闆r，必然導致中華鱉野外種群形成小群體，加速了繁殖群體的日益縮小，增加了近交頻率的發(fā)生，容易出現(xiàn)小群體效應，最終造成2個中華鱉群體遺傳多樣性處于較低水平，這也從基因水平說明了其處于瀕危狀態(tài)的現(xiàn)狀，因此開展對中華鱉野生群體遺傳多樣性的保護工作勢在必行。

3.2群間遺傳分化分析

Thorp研究認為，種群間的遺傳距離為0.03～0.20（遺傳相似度是0.80～0.97）[14]。本研究中，中華鱉2個群體的遺傳距離為0.053 1，表明花鱉群體、普通群體之間的遺傳分化處于群間差異，還未達到種間水平。聚類分析表明，中華鱉2個群體分別聚類，已經存在明顯歧化，揭示花鱉群體與普通群體已經形成各自獨立的遺傳結構，兩者產生了明顯的遺傳分化。太湖花鱉屬于中華鱉的地方特色品種，與中華鱉普通品種在形態(tài)上存在較大不同，本研究中兩者遺傳分化程度雖然還沒有達到種間水平，但已經產生了明顯的遺傳趨異，可能分屬于不同的亞種群，這與研究關于不同群體中華鱉形態(tài)多樣性分析結果一致。當然，中華鱉花鱉群體與普通群體之間分類關系的確定，除了分子和形態(tài)方面的研究，還有賴于器官組織和細胞水平方面的研究予以論證。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS][HJ1.8mm]

[1]張海英，許勇，王永健. 分子標記技術概述（下）[J]. 長江蔬菜，2001，2（3）：15-16.

[2]Zabeau M，Vos P. Selective restriction fragment amplification：a general method for DNA fingerprinting：European Patent Office，92402629.7[P]. 1993-10-05.

[3]陳省平. AFLP標記在扇貝種質鑒定及其遺傳結構分析中的應用[D]. 青島：中國海洋大學，2004.

[4]Golubtsov A S，Berendzen P B. Morphological evidence for the occurrence of two electric catfish（Matapterurus）species in the White Nile and Omo-Turkana systems（East Africa）[J]. J Fish Bio，1999，55（3）：492-505.

[5]Gibson A R，Baker A J，Moeed P. Morphometric variation in introduced populations of the common myna（Aeridotheres tristis）：an application of the jackknife to principal component analysis[J]. Systematic Zoology，1984，33（4）：408-421.

[6]唐偉. 姚江水系中華鱉種質特征研究[D]. 上海：上海海洋大學，2015.

[7]韓曉磊，徐建榮，李小蕊，等. 鳡魚群體遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 南京師大學報：自然科學版，2009，32（1）：110-114.

[8]匡友誼，佟廣香，尹家勝，等. 呼瑪河哲羅魚遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 中國水產科學，2007，14（4）：615-621.

[9]陳煉. 中國水域江豚和中華白海豚的保護遺傳學研究[D]. 南京：南京師范大學，2009.

[10]Wang W，Chen L Q，Yang P，et al. Assessing genetic diversity of populations of topmouth culter （Culter alburnus） in China using AFLP markers[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2007，35（10）：662-669.

[11]Chu B. The technology of using ground heat for soft-shelled turtle overwintering culture[J]. Proceedings of the International Symposium of Agricultural Engineering，1989，89：993-994.

[12]Eisenhour D J. Systematics of Macrhybopsis tetranema（Cyprini-forms；Cyprinidae）[J]. Copoia，1999（4）：969-980.

[13][JP3]IUCN. The 2016 IUCN red list of threatened species[DB/CD]. 2016.

[14]Thorp J P. The molecular dock hypothesis：biochemical evolution，gemetic differentiation，and systematics[J]. Annual Review of Ecology Systematics，1982，13（1）：139-168.