劉暢，謝翠松，陶松桔，宋衛(wèi)紅

(郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州 423000)

過表達S100A13基因的甲狀腺癌TT細胞侵襲能力變化

劉暢，謝翠松，陶松桔，宋衛(wèi)紅

(郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州 423000)

目的 觀察過表達S100A13基因的甲狀腺癌TT細胞侵襲能力變化情況。方法 分別用pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13表達質(zhì)粒和pcDNA3.1/NT-GFP空質(zhì)粒轉染TT細胞，構建空載體pCDNA3.1/NT-GFP-TT細胞系(空載體組)和S100A13穩(wěn)定過表達甲狀腺癌TT細胞系(S100A13過表達組)，采用Transwell侵襲實驗觀察兩組細胞的侵襲能力，蛋白印跡法檢測兩組細胞酸性成纖維細胞生長因子1(FGF-1)、細胞周期蛋白E(Cyclin E)、CD31蛋白表達。結果 S100A13過表達組、空載體組穿出基質(zhì)膜的細胞數(shù)分別為(83.7±5.0)與(40.0±1.7)個，兩組比較P<0.01。S100A13過表達組、空載體組細胞FGF-1蛋白相對表達量分別為1.224±0.124、0.837±0.152，Cyclin E蛋白相對表達量分別為1.034±0.131、0.459±0.032，CD31蛋白相對表達量分別為1.147±0.144、0.312±0.071，兩組比較，P<0.05或<0.01。結論 過表達S100A13基因的甲狀腺癌TT細胞侵襲能力增強，這可能與S100A13促進FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白表達有關。

甲狀腺癌；S100A13基因；細胞侵襲；酸性成纖維細胞生長因子1；細胞周期蛋白E

S100蛋白家族是一個有21個成員的鈣結合蛋白家族，在多種腫瘤中表達異常，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學功能。S100A13是S100蛋白家族中的重要成員之一，在腫瘤及炎癥等疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用[1]。酸性成纖維細胞生長因子1(FGF-1)是成纖維細胞生長因子家族的重要成員之一,其能夠刺激血管內(nèi)皮及平滑肌細胞的增殖與遷移，促進膠原的水解與沉積，最終促進腫瘤細胞的轉移[2]。細胞周期蛋白E(Cyclin E)是G1期重要的周期蛋白,與細胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶結合促進pRB的磷酸化,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CD31即血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子1，是一種相對分子質(zhì)量為130 kD的跨膜糖蛋白，廣泛分布在血管的各種細胞上,尤其在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞的連接處存在高表達，可作為機體血管生成的標志，可直接反映移植瘤的微血管生成情況。本課題組前期建立了S100A13穩(wěn)定過表達人甲狀腺髓樣癌細胞株(TT)，并證實S100A13基因對TT細胞的增殖有促進作用[3]。本研究觀察了過表達S100A13基因的甲狀腺癌TT細胞侵襲能力變化，并探討其機制。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 TT細胞購買于中國科學院細胞庫，用含10%胎牛血清(FBS)的F12K培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中靜置培養(yǎng)。兔抗人FGF-1單克隆抗體、抗人CD31單克隆抗體和Cyclin E單克隆抗體均購于士德生物工程有限公司。

1.2 細胞轉染及分組 分別用pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13表達質(zhì)粒和pcDNA3.1/NT-GFP空質(zhì)粒轉染TT細胞。轉染24 h后采用熒光顯微鏡觀察轉染效率，轉染效率達30%，并換用含有500 μg/mL G418的完全培養(yǎng)基篩選陽性克隆，連續(xù)篩選4周后形成陽性細胞克隆，構建空載體pCDNA3.1/NT-GFP-TT細胞系和S100A13穩(wěn)定過表達TT細胞系。將空載體pCDNA3.1/NT-GFP-TT細胞系(空載體組)和S100A13穩(wěn)定過表達TT細胞系(S100A13過表達組)培養(yǎng)于10%FBS+1%雙抗+RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。0.25%胰酶消化，2～3 d傳代1次。

1.3 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell侵襲實驗。將預冷的無血清RPMI1640培養(yǎng)液按1∶6稀釋基質(zhì)膠，于每個直徑8 μm的Transwell小室中鋪加50 μL基質(zhì)膠稀釋液，再放置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜成膜。次日將已成膜的小室取出，于小室上腔中加入無血清RPMI1640培養(yǎng)液100 μL，放置20 min，使基質(zhì)膠水化。分別取上述兩組細胞(100 μL)接種在小室的上腔，于下腔中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。將小室板置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～36 h后取出，用棉簽輕輕擦棄小室上層細胞，再用PBS液洗滌3遍。將小室置于4%多聚甲醛液中固定10 min，倒置晾干，0.1%結晶祡溶液染色20 min，PBS液清洗，倒置晾干，中性樹膠封片。將小室放置在光學顯微鏡下觀察并拍照，于高倍視鏡下隨機選取4個視野對細胞進行計數(shù)，再取平均值，實驗重復3次。

1.4 細胞FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白檢測 采用蛋白印跡法。提取上述兩組細胞的總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉膜、含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，F(xiàn)GF-1抗體、CD31抗體和Cyclin E抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。去除一抗，TBST洗膜3次，二抗(1∶1 000)、37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白熒光檢測試劑盒(Hyclone．Pierce)顯示結果于X線片。掃描蛋白條帶灰度值，進行定量，以β-actin為對照。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為FGF-1、CD31蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞侵襲能力比較 S100A13過表達組、空載體組穿膜侵襲細胞數(shù)分別為(83.7±5.0)、(40.0±1.7)個，兩組比較，P<0.01。

2.2 兩組細胞FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白相對表達量比較 S100A13過表達組、空載體組細胞FGF-1蛋白相對表達量分別為1.224±0.124、0.837±0.152，Cyclin E蛋白相對表達量分別為1.034±0.131、0.459±0.032，CD31蛋白相對表達量分別為1.147±0.144、0.312±0.071，兩組比較，P<0.05或<0.01。

3 討論

S100A13在心肌、骨骼肌、腦組織、胰腺、腎臟、子宮、小腸、甲狀腺等器官和組織中均有表達，特別在甲狀腺濾泡細胞中高表達。研究[4]發(fā)現(xiàn)，S100A13在乳頭狀甲狀腺癌中的表達明顯高于癌旁正常組織。在黑色素瘤細胞中，S100A13通過調(diào)控細胞因子和NF-κB信號通路參與細胞周期進展和分化[5]，且S100A13的表達狀態(tài)亦與黑色素瘤患者的復發(fā)風險相關[6]。此外，S100A13高表達肺癌細胞侵襲性增強[7]。在轉移性癌癥患者血清中亦發(fā)現(xiàn)S100A13水平升高[8]。上述結果均表明，S100A13增高可能是腫瘤轉移的一個重要預報器。侵襲為腫瘤細胞轉移的第一步，為了探討體外S100A13基因過表達在甲狀腺癌中的侵襲作用，我們建立了穩(wěn)定高表達S100A13基因的TT細胞系，研究S100A13基因過表達在體外對TT細胞侵襲能力的影響。本研究結果發(fā)現(xiàn)，S100A13穩(wěn)定過表達甲狀腺癌TT細胞較空載體pCDNA3.1/NT-GFP-TT細胞穿過基質(zhì)膜的細胞數(shù)明顯增多，表明S100A13過表達能增強甲狀腺癌TT細胞的侵襲能力。

FGF-1是一種廣譜有絲分裂原與促血管生成因子，其通過激活纖維母細胞生長因子受體發(fā)揮生物學效應[9,10]。FGF-1不僅在正常發(fā)育與創(chuàng)傷愈合中扮演著重要角色，也在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)出癌基因樣作用[11]。據(jù)文獻報道，F(xiàn)GF-1在食管腺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達[12～14]，其與血管生成和腫瘤發(fā)生等過程密切相關，并在其中起重要作用[15]。FGF-1可促進血管內(nèi)皮增生，促進血管生成。研究[16]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌中S100A13蛋白表達明顯高于甲狀腺腺瘤和正常組織，其陽性表達與淋巴結轉移相關，與FGF-1表達具有很好的一致性。本研究表明，與空載體組相比，S100A13過表達組FGF-1蛋白高表達。據(jù)此我們推測，S100A13基因過表達能顯著促進TT細胞侵襲可能與FGF-1有關。Cyclin E基因在宮頸鱗癌、卵巢癌、消化道腫瘤、子宮內(nèi)膜癌中的表達增加[4,6,7]。其高表達可縮短G1期進程，使細胞提前進入S期，從而干擾DNA和中心體復制及分裂，導致細胞轉化和腫瘤生成。研究證實，S100A13過表達組中Cyclin E蛋白高表達，S100A13增強甲狀腺癌TT細胞的侵襲能力可能與Cyclin E蛋白高表達促進腫瘤細胞增殖有關。CD31為機體血管生成的標志，可直接反映移植瘤的微血管生成情況[14～18]，腫瘤誘導所產(chǎn)生的腫瘤血管網(wǎng)直接影響腫瘤細胞淋巴結轉移。研究中我們發(fā)現(xiàn)，S100A13過表達組CD31蛋白的表達明顯高于空載體組。因此，S100A13增強甲狀腺癌TT細胞的侵襲能力可能與CD31高表達促進腫瘤血管生成有關。

綜上可見，過表達S100A13基因的甲狀腺癌TT細胞侵襲能力增強，這可能與S100A13促進FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白表達有關。

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湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃課題項目(B2014-176)。

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R736.1

A

1002-266X(2017)02-0040-03