胡依萌，徐焱成

(武漢大學(xué)中南醫(yī)學(xué)，武漢 430071)

CRISPR/Cas9技術(shù)在代謝性疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展

胡依萌，徐焱成

(武漢大學(xué)中南醫(yī)學(xué)，武漢 430071)

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物的基因組編輯技術(shù)，通過對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行敲除和插入，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)修飾。近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)在體內(nèi)脂代謝、肥胖癥、糖尿病、代謝性疾病斑馬魚模型改造等研究中得到了廣泛應(yīng)用。

CRISPR/Cas9；基因編輯；代謝性疾?。恢|(zhì)代謝；肥胖癥；糖尿病

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種不依賴于FokⅠ核酸酶的基因組編輯技術(shù)，它是由細(xì)菌Ⅱ型CRISPR/Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)改造而來，通過對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行敲除、修飾和插入實(shí)現(xiàn)精確高效的基因編輯功能，被譽(yù)為21世紀(jì)以來生命科學(xué)界革命性發(fā)現(xiàn)之一。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于酵母、斑馬魚、果蠅、小鼠、豬和恒河猴的基因組研究中，涉及內(nèi)容有細(xì)胞和動(dòng)物模型建立、功能基因組篩選、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞基因組活性成像和靶向治療等。代謝性疾病是指人體的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等發(fā)生代謝紊亂的病理狀態(tài)，是一組由遺傳和環(huán)境共同作用的癥候群，屬于多基因遺傳病。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，代謝性疾病發(fā)病率逐年增高，已經(jīng)成為心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CRISPR/Cas9技術(shù)可在肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝性疾病中用于篩選功能基因、進(jìn)行基因治療及構(gòu)建疾病模型?，F(xiàn)就CRISPR/Cas9技術(shù)在代謝性疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展綜述如下。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)

CRISPR序列是一種廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中成簇的、規(guī)律間隔的短回文序列，被認(rèn)為是細(xì)菌在對(duì)抗病毒過程中形成的非特異性防御機(jī)制[1]。CRISPR序列上游的前導(dǎo)區(qū)可以啟動(dòng)CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的非編碼RNA前體被命名為pre-crRNA，同時(shí)與其重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA(tracrRNA)也被轉(zhuǎn)錄出來，隨后pre-crRNA在內(nèi)源性RNaseⅢ切割下形成含有重復(fù)序列和間隔序列的成熟crRNA[2]。crRNA與tracrRNA融合成被稱為sgRNA的嵌合RNA分子，sgRNA與靶DNA序列按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則緊密結(jié)合。CRISPR序列與CRISPR關(guān)聯(lián)基因(Cas)共同進(jìn)化，組成高度保守的CRISPR/Cas技術(shù)。Cas基因編碼的蛋白多具有酶活性，如Cas核酸內(nèi)切酶。根據(jù)Cas蛋白的不同將其分為三型——TypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ，其中TypeⅠ和TypeⅢ結(jié)構(gòu)復(fù)雜、應(yīng)用困難，TypeⅡ CRISPR系統(tǒng)組成簡單，只需要核酸酶Cas9在sgRNA引導(dǎo)下定位在PAM保守序列限定的位點(diǎn)——上游3～8 bp位置，即可識(shí)別并切割入侵的外源DNA片段，并整合到CRISPR序列中成為間隔序列，產(chǎn)生免疫記憶[3,4]。當(dāng)相同的外源DNA再次入侵時(shí)，細(xì)胞通過自身的修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的靶向修飾，包括定點(diǎn)突變、敲入、小片段敲除等。2013年，研究者利用細(xì)菌RNA引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)人293T細(xì)胞EMX1和PVALB基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變，首次證明了Cas9核酸酶確實(shí)能用于編輯哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組，從而正式建立了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[5]。之后，相繼發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)可通過基因修飾治療鐮狀細(xì)胞性貧血、杜氏肌營養(yǎng)不良等基因病[6,7]，為疾病治療開辟了新的方向。

相較于目前應(yīng)用最廣泛的基因條件性敲除工具Loxp-Cre系統(tǒng)來說，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于：CRISPR系統(tǒng)中引導(dǎo)sgRNA合成時(shí)只需要在載體插入一段20 bp的DNA，合成的sgRNA只有20個(gè)核苷酸大小，較短的sgDNA序列避免了長序列片段插入載體時(shí)的并發(fā)癥，并且每次只用更換gRNA，操作簡便；同時(shí)對(duì)多位點(diǎn)進(jìn)行修飾，縮短試驗(yàn)周期，減少花費(fèi)[8]。缺點(diǎn)是脫靶效應(yīng)，但有研究[9]發(fā)現(xiàn)如果Cas9需要識(shí)別更長更嚴(yán)格的PAM序列時(shí)可以明顯減少技術(shù)本身的脫靶效應(yīng)，為基因治療提供更有力的條件。還有研究者對(duì)剛剛被發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cpf1技術(shù)產(chǎn)生的基因突變小鼠進(jìn)行全基因Digenome-seq測(cè)試，結(jié)果顯示脫靶效應(yīng)低于0.1%[10]。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在代謝性疾病研究中的應(yīng)用

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國成為糖尿病、高血壓、肥胖、血脂紊亂等代謝性疾病的高發(fā)國家之一，在現(xiàn)有醫(yī)療條件下尚無根治方法。由于代謝性疾病發(fā)病與基因作用密切相關(guān)，CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為這些疾病探索發(fā)病機(jī)制及治療均提供了新的切入點(diǎn)及新方法，它目前的應(yīng)用主要集中在疾病模型的建立及致病基因的修飾治療。

2.1 CRISPR/Cas9技術(shù)在體內(nèi)脂代謝研究中的應(yīng)用 PCSK9基因是除LDLR和APOB之外第三個(gè)與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥有關(guān)的基因，PCSK9發(fā)生功能獲得性突變時(shí)LDL受體水平降低，繼發(fā)LDL-C水平升高[11]。在一項(xiàng)觀察性研究(ARIC)中發(fā)現(xiàn)，PCSK9發(fā)生功能缺失型突變可使非裔美國人和白人的LDL-C水平下降，與心血管事件發(fā)生率的下降有相關(guān)性，PCSK9基因成為治療高脂血癥的新靶點(diǎn)[12]。雖然PCSK9在小腸、肝臟、腎、皮膚和神經(jīng)廣泛表達(dá)，但是只有肝臟產(chǎn)生的PCSK9才能分泌到循環(huán)系統(tǒng)中?；诖嗽?，研究者通過非致病性腺相關(guān)病毒(AAV)成功將CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入小鼠肝臟，在gRNA的幫助下靶向切割PCSK9基因的DNA鏈。3～4 d內(nèi)，PCSK9基因突變率高達(dá)50%以上，成功降低了血漿中PCSK9水平，提高了肝內(nèi)LDL受體水平，降低了血液中LDL-C水平，并且沒有檢測(cè)出脫靶位點(diǎn)[13]。另一項(xiàng)研究將來自金黃色葡萄球菌的Cas9與gRNA在AAV組裝好導(dǎo)入小鼠肝臟中，以PCSK9基因?yàn)槟繕?biāo)DNA，得到與前一項(xiàng)研究相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[14]。首次在基因水平上成功改造PCSK9基因，為家族性高脂血癥的治療提供了依據(jù)。之后，與PCSK9相關(guān)聯(lián)的TRIB1基因被發(fā)現(xiàn)在人肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，肝細(xì)胞過表達(dá)TRIB1基因時(shí)脂肪酸氧化增加，膽固醇和VLDL合成減少，HDL水平升高，但是敲除TRIB1基因時(shí)動(dòng)物呈高血糖狀態(tài)[15]。為進(jìn)一步探索其對(duì)脂代謝的調(diào)控作用，Nagiec等[16]用CRISPR/Cas9誘導(dǎo)破壞TRIB1基因座的染色體，增加了PCKS9轉(zhuǎn)錄和PCKS9蛋白的分泌，從而降低了肝LDL受體水平，血液中LDL-C水平升高，證實(shí)了TRIB1基因?qū)χx的調(diào)節(jié)作用。

CREB3L3是一種在肝臟和小腸中表達(dá)的膜結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子，CREB3L3和過氧化物酶增殖體激活PPARα合成，繼而激活肝臟成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)的表達(dá)，F(xiàn)GF21表達(dá)促進(jìn)白色脂肪的脂解作用和棕色脂肪的生熱作用，降低胰島素抵抗和血甘油三酯水平[17]。Nakagawa等[18]利用CRISPR/Cas9技術(shù)首次獲得了CREB3L3 foxed小鼠，并得到了條件基因敲除(分別在小腸、肝臟中敲除CREB3L3基因)的小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示條件性敲除肝臟中CREB3L3基因的小鼠表達(dá)高膽固醇水平，而小腸中無該效應(yīng)，表明CREB3L3主要在肝臟中發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用。進(jìn)一步證實(shí)CRISPR/Cas9技術(shù)不僅能高效、準(zhǔn)確改造目標(biāo)基因，還能建立動(dòng)物模型探索發(fā)病機(jī)制，為心血管疾病的治療提供新的方法。

2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在肥胖癥研究中的應(yīng)用 肥胖是2型糖尿病、心血管疾病等的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)，從基因水平上治療為肥胖癥帶來了治愈的可能性。研究[19]發(fā)現(xiàn)FTO等位基因與肥胖有關(guān)，它可以在脂肪前體細(xì)胞中抑制線粒體的產(chǎn)熱作用，F(xiàn)TO基因突變抑制白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)化。FTO基因調(diào)控的這條產(chǎn)熱通路涉及ARID5B、rs1421085、IRX3和IRX5因子。FTO基因突變能夠激活脂肪前體細(xì)胞中的一個(gè)主要調(diào)控區(qū)域，開啟兩個(gè)遠(yuǎn)距離基因——IRX3和IRX5，IRX3和IRX5是產(chǎn)熱的關(guān)鍵因子。因此可利用CRISPR/Cas9基因編輯rs1421085來修復(fù)ARID5B的模序結(jié)構(gòu)，抑制IRX3和IRX5的表達(dá)，達(dá)到減肥的效應(yīng)。利用CRISPR/Cas技術(shù)抑制肥胖基因成為治療重度肥胖的潛在方法。

瘦素(Lep)是由一種白色脂肪細(xì)胞分泌的激素，通過中樞的瘦素受體(LepR)作用于下丘腦的代謝調(diào)節(jié)中樞，抑制食欲，減少能量攝取，抑制脂肪合成，并且可以調(diào)控血糖濃度、神經(jīng)內(nèi)分泌等。目前對(duì)肥胖的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者存在Lep抵抗，表現(xiàn)為Lep水平增高、LepR反饋性下降，病理性水平升高的Lep可促進(jìn)大量氧化自由基的產(chǎn)生。對(duì)于Lep/LepR在糖脂代謝中的重要作用，已經(jīng)有多種動(dòng)物模型，其中使用最廣泛的是針對(duì)Lep的ob/ob小鼠和針對(duì)LepR的db/db小鼠。為了更好地研究Lep，Bao等[20]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立LepR敲除模型小鼠，純合子的LepR缺失小鼠表現(xiàn)為肥胖、食欲旺盛、高血糖、胰島素抵抗和脂代謝紊亂，長期處于缺失狀態(tài)繼發(fā)糖尿病并發(fā)癥。該建模方法改進(jìn)了現(xiàn)有的db/db鼠和C57BL/6J鼠的不足，即葡萄糖不耐受發(fā)生較晚，為肥胖癥和糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究提供了快捷的建立通道。在我國，有研究[21]通過CRISPR技術(shù)靶向敲除Lep/LepR基因，經(jīng)體外受精方法將受精卵顯微注射到大鼠體內(nèi)，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)Lep/LepR缺失，成功建立了Lep基因敲除的大鼠模型，彌補(bǔ)了大鼠尚未建立Lep基因敲除模型的空缺。同樣的原理，有研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立細(xì)胞色素酶P450(CYP)2E1基因敲除的小鼠模型，用來探索CYP2E1在生化代謝、毒理、疾病(例如糖尿病、酒精性肝硬化)中的作用，并且在成功建立的CYP2E1基因缺失小鼠中沒有檢測(cè)到脫靶效應(yīng)。

2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在糖尿病研究中的應(yīng)用 2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其主要病理過程是胰島β細(xì)胞數(shù)量減少和功能障礙，所以研究胰島β細(xì)胞對(duì)于糖尿病的診治具有重要意義。一項(xiàng)研究[23]利用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生新的Cre工具小鼠，以實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺β細(xì)胞的基因操作，實(shí)驗(yàn)以Ins1啟動(dòng)子(胰島素基因)終止密碼子序列作為重組酶Cre插入的目標(biāo)，將包含有編碼gRNA和Cas9序列的pX330以及供體DNA質(zhì)粒注射到卵母細(xì)胞中，該小鼠與flox小鼠(在待敲除的一段目的DNA序列的兩端各放置一個(gè)loxp序列)交配得到子代(F1)小鼠。子代F1小鼠胚胎期和成年期組織學(xué)上被標(biāo)記為Cre-loxP重組，而Cre-loxP重組可以在所有表達(dá)胰島素陽性細(xì)胞的胰島中被觀察到，而在其他組織陰性表達(dá)，提示β細(xì)胞特異性重組完成。且其與野生型小鼠葡萄糖耐受力無明顯差異。綜上，利用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生的雙順反子敲入Cre工具鼠有助于研究胰島β細(xì)胞功能及糖代謝。

人多能干細(xì)胞(hiPSC)也廣泛應(yīng)用在體外疾病模型的建立中。CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合hiPSC細(xì)胞靶向修飾糖尿病相關(guān)基因，建立與人類發(fā)病更為接近的模型，成為探索糖尿病分子機(jī)制極具潛力的方法[24]。例如，從單基因糖尿病MODY患者體內(nèi)分離培養(yǎng)hiPSC，用CRISPR對(duì)HNF4A、GCK、PDX-1、INS等可能突變的基因進(jìn)行編輯，誘導(dǎo)分化為胰腺祖細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。同理，新生兒糖尿病可編輯KCNJ11等，1型糖尿病可編輯HLA DR-DQ、HLA-B、HLA-A、INS等，2型糖尿病可編輯TCF7L2、IGF2BP2、IRS1、KCNQ1等。這些人工的轉(zhuǎn)錄因子可由特異性的gRNA導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，選擇性調(diào)控多能干細(xì)胞分化為胰腺細(xì)胞，克服了體內(nèi)干細(xì)胞來源的胰島樣細(xì)胞成熟障礙，為胰腺移植提供豐富的供體。

隨著對(duì)CRISPR/Cas技術(shù)進(jìn)一步的研究，出現(xiàn)了更多的衍生物，例如CRISPR干擾技術(shù)(CRISPRi技術(shù))和CRISPR激活技術(shù)(CRISPRa技術(shù))。CRISPRi技術(shù)是一項(xiàng)基于傳統(tǒng)CRISPR/Cas技術(shù)改進(jìn)的新型基因調(diào)控工具，通過在特定編碼基因附近的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)肴诤限D(zhuǎn)錄因子抑制劑的dCas9，無需切割DNA而使該基因沉默。CRISPRa技術(shù)是在特定編碼基因附近的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)肴诤限D(zhuǎn)錄因子激活劑的dCas9，使該基因表達(dá)水平上調(diào)[25]。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因精確的上調(diào)和下調(diào)。糖尿病作為一種多基因病，未來可利用CRISPRi和CRISPRa技術(shù)建立文庫篩選促進(jìn)、抑制胰島β細(xì)胞生長和凋亡的多個(gè)基因。

2.4 CRISPR/Cas9技術(shù)在代謝性疾病斑馬魚模型改造中的應(yīng)用 斑馬魚是研究代謝性疾病最合適的動(dòng)物模型，因?yàn)樗鼡碛腥祟惪刂拼x的所有關(guān)鍵器官，從下丘腦的食欲中樞到胰腺和胰島素靶向器官，但不同于人類的是，斑馬魚是一種變溫動(dòng)物，目前尚未在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕色脂肪。斑馬魚模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肥胖、糖尿病、脂肪肝的研究中。2013年，Hwang等[26]首次將Cas9 mRNA和特定的gRNA注射到斑馬魚細(xì)胞期受精卵內(nèi)，得到drd3、gsk3b兩個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)定點(diǎn)突變的突變體，CRISPR/Cas9技術(shù)成功使目標(biāo)基因失活，實(shí)現(xiàn)了對(duì)斑馬魚基因組的靶向操作。隨后在我國，程呈等[27]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)靶點(diǎn)的gRNA，誘導(dǎo)靶點(diǎn)突變，經(jīng)測(cè)序鑒定得到突變體，成功構(gòu)建了RFX6基因敲除的斑馬魚動(dòng)物模型，結(jié)果顯示RFX6純合突變體生長發(fā)育遲滯、體型瘦小、呈現(xiàn)糖尿病消瘦體型并且不能產(chǎn)生后代，該項(xiàng)研究說明了RFX6基因?qū)τ谝认侔l(fā)育的重要作用。另一項(xiàng)研究[28]將Cas9 mRNA、sgRNA和含有Cas9識(shí)別位點(diǎn)的Gal4質(zhì)粒一起注射到斑馬魚細(xì)胞期受精卵中，成功地將Gal4序列插入到轉(zhuǎn)基因斑馬魚的GFP基因中。這些研究表明CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)斑馬魚基因組敲除和敲入，可為研究內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病提供有效工具。

CRISPR/Cas技術(shù)給人類基因組的研究帶來了巨大的便利，其高效、靈活、多位點(diǎn)對(duì)靶向基因進(jìn)行編輯，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個(gè)體化治療創(chuàng)造巨大的空間。其在代謝性疾病中的應(yīng)用才剛剛開始，以后會(huì)有更多的發(fā)展。近年來發(fā)現(xiàn)的糖尿病易患基因接近60個(gè)，包括TcF7L2變異、UCP2基因過度表達(dá)、SLC16A11序列突變等，可以構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的CRISPR-Cas9 knockout文庫，并且建立功能基因篩選平臺(tái)以及通過高通量測(cè)序技術(shù)分析數(shù)據(jù)的一整套技術(shù)路線，從而篩選出更多2型糖尿病的致病基因，并在小鼠體內(nèi)模擬基因突變的效應(yīng)，構(gòu)建與患者具有相同遺傳譜的小鼠，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行個(gè)體化治療的效果是前所未有的。另外，Cas9對(duì)甲基化酶或去甲基化酶、乙?；富蛉ヒ阴；傅却龠M(jìn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變異的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，在表觀遺傳學(xué)上治療糖尿病也是新的方向?？傊珻RISPR/Cas9將會(huì)給代謝性疾病的研究帶來新的機(jī)遇和發(fā)展。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370872)。

徐焱成(E-mail： xycc567@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.034

R589

A

1002-266X(2017)02-0097-04

2016-08-12)