楊海峰，黃淑紅

(1北京市仁和醫(yī)院，北京102600；2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

腦膠質(zhì)瘤組織中酪氨酸激酶受體B表達(dá)及其與病理分級(jí)的關(guān)系

楊海峰1，黃淑紅2

(1北京市仁和醫(yī)院，北京102600；2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的 觀察腦膠質(zhì)瘤組織中酪氨酸激酶受體B(TrkB)的表達(dá)情況，并探討其與病理分級(jí)的關(guān)系。方法 將45例份腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除腫瘤組織作為觀察組，其中Ⅰ+Ⅱ級(jí)18例份(低級(jí)別)、Ⅲ+Ⅳ級(jí)27例份(高級(jí)別)；另取10例份正常腦組織作為對(duì)照組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組TrkB mRNA表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色、Western blot法檢測(cè)兩組TrkB蛋白表達(dá)，分析腦膠質(zhì)瘤TrkB蛋白表達(dá)與病理分級(jí)的關(guān)系。結(jié)果 觀察組、對(duì)照組腦組織中TrkB mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.188 1±0.030 1、0.083 5±0.037 4，TrkB蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.955 6±0.063 7、0.448 9±0.072 4，兩組相比，P均<0.05。低級(jí)別、高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中TrkB mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.101 4±0.027 9、0.237 1±0.038 3，TrkB蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.765 3±0.048 1、1.082 5±0.083 5，兩者相比，P均<0.05。結(jié)論 腦膠質(zhì)瘤組織中TrkB表達(dá)升高，高病理分級(jí)較低病理分級(jí)TrkB表達(dá)高。

腦膠質(zhì)瘤；酪氨酸激酶受體B；病理分級(jí)

腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，可在腦實(shí)質(zhì)中浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，侵襲性強(qiáng)，手術(shù)很難進(jìn)行完全切除，且其復(fù)發(fā)率高、治愈率低、預(yù)后差。受體酪氨酸激酶B(TrkB)作為一種癌基因，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)[1]，并通過與其配體——腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)結(jié)合激活一系列重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)控[2～6]。TrkB作為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)受到越來越多的關(guān)

注，但目前有關(guān)TrkB在腦膠質(zhì)瘤中的作用研究較少。本研究觀察了腦膠質(zhì)瘤組織中TrkB的表達(dá)變化，并探討其與腫瘤病理分級(jí)的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2013年5月～2015年12月北京市仁和醫(yī)院45例份腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除腫瘤組織作為觀察組，均經(jīng)病理檢查確診。腦膠質(zhì)瘤患者中男31例、女14例，年齡7～75歲、中位年齡41歲，其中>60歲6例、≤60歲39例。以2007年WHO腦腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ級(jí)9例、Ⅱ

級(jí)9例、Ⅲ級(jí)13例、Ⅳ級(jí)14例。以Ⅰ+Ⅱ級(jí)為中低度惡性(低級(jí)別)，Ⅲ+Ⅳ級(jí)為高度惡性(高級(jí)別)。另選10例份同期顱腦外傷術(shù)中切除的正常腦組織作為對(duì)照組。所有病例術(shù)前未進(jìn)行放、化療，均有詳細(xì)的臨床資料，本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 腦組織TrkB mRNA檢測(cè) 將上述兩組部分組織標(biāo)本用4%中性甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，保存切片；另外部分標(biāo)本于-80 ℃冰箱保存。取新鮮冰凍腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織，提取RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。TrkB mRNA的上游引物：5′-GTCCAGACACTCAGGATTTG-3′，下游引物:5′-TCCTCCACAGTGAGGTTAG-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物均為0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用2-ΔΔCt分析法分析TrkB mRNA相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 腦組織TrkB蛋白檢測(cè) ①免疫組織化學(xué)染色：對(duì)腦膠質(zhì)瘤及正常腦組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)EnVision法染色，具體步驟如下。60 ℃烘烤石蠟切片2 h，切片脫蠟至水；雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中90 ℃微波抗原修復(fù)8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h；兔抗人TrkB抗體(1∶200，美國(guó)Abcam公司)室溫孵育1 h后4 ℃過夜；聚合物增強(qiáng)劑室溫孵育20 min，酶標(biāo)抗鼠聚合物室溫孵育25 min，常規(guī)DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，同時(shí)做空白對(duì)照，已知陽性片作為陽性對(duì)照，以細(xì)胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕色顆粒為陽性細(xì)胞，無著色則為陰性。在光學(xué)顯微鏡40×10視野下，每個(gè)樣本選取5個(gè)視野，采用Barnes法統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，按棕色顯色細(xì)胞的比例進(jìn)行計(jì)分，<1%計(jì)0分、1%～<11%計(jì)1分、11%～<51%計(jì)2分、51%～<80%計(jì)3分、≥80%計(jì)4分，將1～4分定義為陽性、0分為陰性。②采用Western blot法。取新鮮冰凍腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和正常腦組織按照質(zhì)量體積比1∶3加入組織裂解液進(jìn)行裂解，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗兔抗人TrkB抗體/鼠抗人β-tubulin抗體(1∶1 000，美國(guó)Sigma公司)4 ℃孵育過夜，洗滌后加二抗HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體(1∶5 000，美國(guó)Abcam公司)孵育1 h，洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。采用Image J分析所得圖像，以TrkB/β-tubulin灰度比值表示TrkB蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組腦組織TrkB mRNA表達(dá)比較 觀察組、對(duì)照組腦組織中TrkB mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.188 1±0.030 1、0.083 5±0.037 4，兩組相比，P<0.05。

2.2 兩組腦組織TrkB蛋白表達(dá)比較 免疫組化染色結(jié)果顯示TrkB蛋白在腦組織胞質(zhì)中呈棕色顆粒狀。觀察組TrkB蛋白表達(dá)1、2、3、4分分別為4、2、12、27例，對(duì)照組分別為8、2、0、0例，兩組比較P<0.05。Western blot結(jié)果顯示，觀察組、對(duì)照組腦組織中TrkB蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.955 6±0.063 7、0.448 9±0.072 4，兩組相比，P<0.05。

2.3 腦膠質(zhì)瘤TrkB表達(dá)與病理分級(jí)的關(guān)系 低級(jí)別、高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中TrkB mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.101 4±0.027 9、0.237 1±0.038 3，TrkB蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.765 3±0.048 1、1.082 5±0.083 5，兩者相比，P均<0.05。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤為顱內(nèi)最常見的腫瘤，發(fā)病率高，惡性程度高。雖然近幾年腦膠質(zhì)瘤的治療技術(shù)迅速發(fā)展，但目前其臨床治療效果仍不滿意[7]。目前，靶向治療作為一種新興的治療方法逐漸應(yīng)用于膠質(zhì)瘤治療。研究[8,9]發(fā)現(xiàn)，一些非編碼RNA對(duì)靶向治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有良好的治療效果。除此之外，一些在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因也是重要的分子靶點(diǎn)，現(xiàn)已證明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子是常用的抑制腫瘤血管生長(zhǎng)的重要靶點(diǎn)[10]，與VEGF作用的單克隆抗體藥物貝伐珠單抗現(xiàn)已用于復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療[11,12]。

TrkB是BDNF的高親和力特異性受體，TrkB與BDNF結(jié)合后會(huì)發(fā)生磷酸化而被激活[13]，活化的TrkB可以誘導(dǎo)PI3K的活性，導(dǎo)致Akt的激活，進(jìn)而通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)等生理活動(dòng)[3～5]；TrkB/BDNF還可以激活MAPK和PLC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等。越來越多的研究表明，TrkB/BDNF與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，TrkB/BDNF信號(hào)途徑的激活會(huì)刺激腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管的發(fā)生，同時(shí)還會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡[14]。TrkB在多種實(shí)體瘤中過表達(dá)，如肺癌[6]、鼻咽癌、舌鱗狀細(xì)胞癌[15]、食管鱗癌[16]、肝癌[17]、結(jié)腸癌[18]、子宮內(nèi)膜癌[19]等。TrkB在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中異常高表達(dá)，并能促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的擴(kuò)散和浸潤(rùn)能力[20,21]。在鼻咽癌中，高表達(dá)的TrkB通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性[14,22]。因此，TrkB作為一種原癌基因，在惡性腫瘤生成機(jī)制中的作用越來越受到重視，并且研究認(rèn)為TrkB可以作為抗腫瘤靶向治療的新靶點(diǎn)[14]。本研究觀察了腦膠質(zhì)瘤組織中TrkB蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)TrkB在腦膠質(zhì)瘤組織中異常高表達(dá)，且在高病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量明顯高于低病理分級(jí)，不管是在mRNA水平還是蛋白水平，這與Xiong等[21]的研究結(jié)果一致。除此之外，腦膠質(zhì)瘤組織中TrkB的異常高表達(dá)與患者的年齡、性別無關(guān)，但與病理分級(jí)有關(guān)，且病理分級(jí)越高TrkB表達(dá)量越高，表明TrkB的異常高表達(dá)可能與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，TrkB可能在腦膠質(zhì)瘤由低級(jí)向高級(jí)轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)揮重要作用。有研究[23]表明，卵巢上皮癌中TrkB的過表達(dá)使PI3K/Akt信號(hào)通路過度激活，導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移性增強(qiáng)。關(guān)于TrkB影響腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來探索。

綜上可見，腦膠質(zhì)瘤組織中TrkB表達(dá)升高，高病理分級(jí)較低病理分級(jí)TrkB表達(dá)高。抑制TrkB的過表達(dá)可能對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療提供幫助。

[1] Brodeur GM, Nakagawara A, Yamashiro DJ, et al. Expression of TrkA, TrkB and TrkC in human neuroblastomas[J]. J Neurooncol, 1997,31(1-2):49-56.

[2] Liu Q, Wong-Riley MT. Postnatal development of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and tyrosine protein kinase B (TrkB) receptor immunoreactivity in multiple brain stem respiratory-related nuclei of the rat[J]. J Comp Neurol, 2013,521(1):109-129.

[3] Qi D, Ouyang C, Wang Y, et al. HO-1 attenuates hippocampal neurons injury via the activation of BDNF-TrkB-PI3K/Akt signaling pathway in stroke[J]. Brain Res, 2014,1577(7):69-76.

[4] Luo L, Liu XL, Li J, et al. Macranthol promotes hippocampal neuronal proliferation in mice via BDNF-TrkB-PI3K/Akt signaling pathway[J]. Eur J Pharmacol, 2015,762(8):357-363.

[5] Xiang J, Pan J, Chen F, et al. L-3-n-butylphthalide improves cognitive impairment of APP/PS1 mice by BDNF/TrkB/PI3K/AKT pathway[J]. Int J Clin Expe Med, 2014,7(7):1706-1713.

[6] Odate S, Nakamura K, Onishi H, et al. TrkB/BDNF signaling pathway is a potential therapeutic target for pulmonary large cell neuroendocrine carcinoma[J]. Lung Cancer, 2013,79(3):205-214.

[7] 陳正和,陳忠平.腦膠質(zhì)瘤的治療進(jìn)展[J].新醫(yī)學(xué),2015，46(7):417-422.

[8] 郝萱語,李方方,王萍.非編碼RNA靶向治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2015，55(30):92-94.

[9] An S, Jiang X, Shi J, et al. Single-component self-assembled RNAi nanoparticles functionalized with tumor-targeting iNGR delivering abundant siRNA for efficient glioma therapy[J]. Biomaterials, 2015,53(2):330-340.

[10] Gatson N, Chiocca EA, Kaur B. Anti-angiogenic gene therapy in the treatment of malignant gliomas[J]. Neurosci Lett, 2012,527(2):62-70.

[11] Kaloshi G, Brace G, Rroji A, et al. Bevacizumab alone at 5 mg/kg in an every-3-week schedule for patients with recurrent glioblastomas: a single center experience[J]. Tumori, 2013,99(5):601-603.

[12] 陳寶師,晉強(qiáng),張忠,等.聯(lián)合靶向治療復(fù)發(fā)惡性腦膠質(zhì)瘤的研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2015,14(7):740-742.

[13] Jia S, Wang W, Hu Z, et al. BDNF mediated TrkB activation contributes to the EMT progression and the poor prognosis in human salivary adenoid cystic carcinoma[J]. Oral Oncol, 2014,51(1):6115-6120.

[14] 莫賽軍,鄭乃剛,曹文波,等.BDNF/TrkB信號(hào)途徑與抗腫瘤治療[J].癌變·畸變·突變,2014,26(6):476-478.

[15] 魏秀娟,吳修胤,佟冬冬,等.BDNF/TrkB在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及BDNF對(duì)其增殖能力的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,54(6):50-54.

[16] 許躍,李晟磊,范欽和.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與其受體酪氨酸激酶B在食管鱗癌中蛋白表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2015,32(12):3176-3178.

[17] 張克蘭,王志明,陳能志,等.BDNF,TrkB在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及BDNF對(duì)肝癌細(xì)胞株Bel-7402的作用[J].中國(guó)普通外科雜志,2010,19(5):516-524.

[18] 鄭偉平,黎敏華,陶萍萍,等.TrkB在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義[J].實(shí)用腫瘤雜志,2014,29(1):41-44.

[19] 劉建英.TrkB-BDNF信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞耐藥和轉(zhuǎn)移的影響[J].中華小兒外科雜志,2013,34(8):607-612.

[20] Croucher JL, Iyer R, Li N, et al. TrkB inhibition by GNF-4256 slows growth and enhances chemotherapeutic efficacy in neuroblastoma xenografts[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2014,75(1):131-141.

[21] Xiong J, Zhou LI, Lim Y, et al. Mature brain-derived neurotrophic factor and its receptor TrkB are upregulated in human glioma tissues[J]. Oncol Lett, 2015,10(1):223-227.

[22] Ng YK, Wong EY, Lau CP, et al. K252a induces anoikis-sensitization with suppression of cellular migration in Epstein-Barr virus (EBV)--associated nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Investl New Drugs, 2012,30(1):48-58.

[23] Yu X, Liu L, Cai B, et al. Suppression of anoikis by the neurotrophic receptor TrkB in human ovarian cancer[J]. Cancer Sci, 2008,99(3):543-552.

(收稿日期：2016-09-06)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271519)。

黃淑紅(E-mail： huangshdoctor@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.020

R739.41

B

1002-266X(2017)02-0060-03

2016-09-05)