何然+汪宏錦+周瑩+李晶晶+徐曉玉

[摘要]觀察四物湯對幼鼠缺鐵性貧血的改善作用及其對鐵代謝調(diào)節(jié)的機制。該研究用低鐵飼料飼喂斷乳的SD大鼠2周后，篩選出血紅蛋白少于75 g·L^-1的大鼠，隨機分為模型組，琥珀酸亞鐵組（50 mg·kg^-1），四物湯組（4，8，16 g·kg^-1），灌胃給藥4周。制作血涂片和肝臟HE染色，測定血常規(guī)、血清鐵、總鐵結(jié)合力、血清鐵蛋白、肝臟鐵、血清鐵調(diào)素和肝臟鐵調(diào)素含量，測定肝臟鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組活動量減少，耳廓和腳趾呈蒼白色；紅細胞數(shù)量減少，體積變小，中央淡染區(qū)擴大；體重和各血常規(guī)參數(shù)顯著降低；肝臟呈淺紅色，中央靜脈周圍的肝細胞索分界不清晰，排列雜亂；血清鐵、血清鐵蛋白、肝臟鐵含量和肝臟鐵蛋白表達顯著降低；總鐵結(jié)合力、血清鐵調(diào)素、肝臟鐵調(diào)素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達顯著升高，顯示造模成功。與模型組相比，四物湯組活動量增多，耳廓和腳趾色澤紅潤；紅細胞數(shù)量增多，體積變大，中央淡染區(qū)縮??；體重和血常規(guī)各參數(shù)顯著升高；肝臟顏色變紅，中央靜脈周圍的肝細胞索分界較清晰，排列趨于整齊；血清鐵、血清鐵蛋白、肝臟鐵含量和肝臟鐵蛋白表達顯著升高；總鐵結(jié)合力、血清鐵調(diào)素、肝臟鐵調(diào)素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達顯著降低。研究表明，四物湯對幼鼠缺鐵性貧血具有較好的改善作用，其機制可能與改善鐵調(diào)素對鐵代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 缺鐵性貧血； 四物湯； 幼鼠； 鐵代謝； 鐵調(diào)素

[Abstract] To investigate the effect of Siwu decoction on improving iron deficiency anemia in infant rats and observe its regulatory effects on iron metabolism. SD rats were fed with low iron fodder for 2 weeks， and then the rats with hemoglobin level less than 75 g·L^-1 were screened out and randomly divided into model group， Ferrous succinate 50 mg·kg^-1 group， Siwu decoction 4 g·kg^-1， 8 g·kg^-1 and 16 g·kg^-1 groups. After 4 weeks′ gavage administration， Wright-Giemsa′s staining of blood smear and HE staining of the livers were conducted， and all rats were tested for blood routine， serum iron， total iron binding capacity， serum ferritin， serum hepcidin and liver hepcidin. The expression levels of liver ferritin， transferrin and transferrin receptor 1 were also detected. The results showed that as compared with normal group， the activity level of model group was decreased， and the color and lustre of auricles and toes were pale white； the number of red blood cells was decreased； the volume was smaller， with an increased zone of central pallor； the body weight and blood routine parameters were decreased significantly； the livers were pale red， and the hepatic cords around thecentral veins were unclear and misaligned； the serum iron， serum ferritin， liver iron levels and the expression of liver ferritin were decreased significantly； the total iron binding capacity， serum hepcidin， liver hepcidin， the expression levels of liver transferrin and transferrin receptor 1 were significantly increased， indicating successful establishment of models.As compared with the model group， activity was increased in Siwu decoction group； the color and lustre of auricles and toes were ruddy； the number of red blood cells was increased； the volume was larger， with a decreased zone of central pallor； the body weight and blood routine parameters were increased significantly； the livers were red， hepatic cords around the central veins were clear and aligned；the serum iron， serum ferritin， liver iron levels and the expression of liver ferritin were significantly increased， the total iron binding capacity， serum hepcidin， liver hepcidin， the expression of liver transferrin and transferrin receptor 1 were decreased significantly. The results demonstrated that Siwu decoction had a certain effect on improving iron deficiency anemia in infant rats， and the mechanism may be associated with the regulatory effect of hepcidin iron metabolism.

[Key words] iron deficiency anemia； Siwu decoction； infant rats； iron metabolism； hepcidin

貧血影響著世界上大約三分之一人口的健康，其中有一半是鐵缺乏造成的^[1]。缺鐵性貧血的發(fā)病率在經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)的嬰幼兒、育齡婦女中明顯增高^[2]。目前，口服鐵劑被認為是最佳的治療手段^[1]，但口服鐵劑存在一些副作用，如常見的胃腸道反應(yīng)等；并且過量補充鐵劑會造成機體鐵超載，誘發(fā)肝臟、心血管損害和神經(jīng)退行性病變^[3]。

四物湯來自《仙授理傷續(xù)斷秘方》，由川芎、當歸、熟地黃和白芍組成，是經(jīng)典的中醫(yī)補血方劑。但以往對四物湯的研究主要是通過放血、輻射損傷或注射環(huán)磷酰胺誘導骨髓抑制建立成年大、小鼠血虛模型，來觀察其在造血系統(tǒng)^[4-6]、免疫調(diào)節(jié)^[7-8]和抗射線損傷^[9-11]等方面的作用，而未見四物湯對幼年缺鐵性貧血大鼠及對鐵代謝調(diào)節(jié)的研究。本實驗擬研究四物湯對幼鼠缺鐵性貧血的改善作用及其對鐵代謝的調(diào)節(jié)機制，為將四物湯應(yīng)用于治療婦女及嬰幼兒貧血提供部分臨床前試驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物與飼料 80只SPF級21 d斷乳SD大鼠，雌雄各半，購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所，生產(chǎn)許可證號SCXK（渝）2012-0006，實驗動物質(zhì)量合格證號No.0001728；飼養(yǎng)于西南大學藥學院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK（渝）2014-0002。大鼠的飼養(yǎng)和使用均符合中國《實驗動物管理條例》。AIN-93G標準飼料（含鐵量約為0.004 5%）和AIN-93G低鐵飼料（含鐵量約為0.000 4%）均購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 藥材與試劑 四物湯由川芎-當歸-熟地黃-白芍按2∶3∶4∶3比例組成。藥材均購自重慶鑫斛藥房連鎖有限公司，經(jīng)西南大學藥學院齊紅藝教授鑒定均為正品。琥珀酸亞鐵片購自四川奧邦藥業(yè)有限公司?？焖偃鸺先疽骸⒀彖F、總鐵結(jié)合力和組織鐵測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。HE染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。鐵蛋白和鐵調(diào)素酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海優(yōu)選生物科技有限公司。RIPA裂解液、PMSF和BCA蛋白定量測定試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。鐵蛋白（10727-1-AP）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（17435-1-AP）和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（10084-2-AP）抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。山羊抗兔IgG（bs-0295G）抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠）；全自動血液細胞分析儀（BC-2800 Vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；病理切片機（RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；臺式低溫高速離心機（5417R，德國Eppendorf生命科學有限公司）；酶標儀（Elx800，美國BioTek儀器有限公司）；電泳槽和轉(zhuǎn)印槽（美國BIO-RAD生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）；全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon5200，上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 四物湯提取物配制 稱取川芎20 g、當歸30 g、熟地黃40 g、白芍30 g，添加10倍量水，浸泡30 min后，于中藥煎藥壺中煎煮60 min，用紗布過濾。殘渣中再添加10倍量水，再煎煮60 min后過濾。合并濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至含生藥濃度1.6，0.8，0.4 g·mL^-1，4 ℃存放，備用。

2.2 造模與分組 將80只21 d斷乳大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為正常組10只和造模組70只，編號后飼養(yǎng)于不銹鋼籠中。正常組飼喂標準飼料，造模組飼喂低鐵飼料，自由飲去離子水，飼養(yǎng)過程中盡量避免鐵接觸。2周后，造模組大鼠內(nèi)眥靜脈采血200 μL，EDTA抗凝后測定血常規(guī)，篩選出50只血紅蛋白含量少于75 g·L^-1的大鼠作為造模成功大鼠。將其雌雄各半隨機分為模型組，琥珀酸亞鐵50 mg·kg^-1，四物湯4，8，16 g·kg^-1組，每組10只。

2.3 給藥 除正常組和模型組灌胃等體積水外，其余4組分別灌胃設(shè)定劑量的琥珀酸亞鐵或四物湯提取物，連續(xù)給藥4周。給藥期間，各組大鼠繼續(xù)飼喂標準或低鐵飼料，自由飲去離子水。

2.4 大鼠一般情況觀察和體重測定 分別觀察各組大鼠精神狀態(tài)、活動、毛色、耳廓、腳趾等情況，用天平稱量大鼠體重，并比較各組差異。

2.5 組織樣本制備 給藥4周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，內(nèi)眥靜脈采血1.5 mL，EDTA抗凝后備測。另采血1.5 mL，不抗凝，靜置24 h后，3 000 r·min^-1離心10 min，分離得到血清，-80 ℃保存。1%戊巴比妥鈉按40 mg·kg^-1劑量腹腔注射麻醉后，冰上分離肝臟，-80 ℃保存。

2.6 血涂片染色 滴加1滴血液于干凈的載玻片上，推片，待血膜干燥后，嚴格按照說明書進行瑞氏-吉姆薩染色，鏡檢。

2.7 肝臟HE染色 將肝臟固定于4%多聚甲醛24 h以上，梯度脫水后包埋，行石蠟切片，片厚5 μm，嚴格按照說明書進行HE染色，鏡檢。

2.8 生化指標檢測 采用全自動血液細胞分析儀測定血常規(guī)參數(shù)。采用比色法嚴格按照說明書測定血清鐵，總鐵結(jié)合力和肝臟鐵含量。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法嚴格按照說明書測定血清鐵蛋白，血清鐵調(diào)素和肝臟鐵調(diào)素含量。

2.9 Western blot檢測 將肝臟置于4 ℃預(yù)冷的生理鹽水中，剪碎，加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 13 000 r·min^-1離心5 min，取上清液，嚴格按照說明書采用BCA法測定蛋白濃度。用去離子水將各蛋白樣品調(diào)至等濃度，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻，制備10% SDS-PAGE凝膠后，加入等量蛋白樣品電泳分離蛋白后，用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗（鐵蛋白 1∶500，轉(zhuǎn)鐵蛋白 1∶200，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1 1∶500）過夜，TBST洗膜4次，每次10 min。室溫孵育二抗（山羊抗兔IgG 1∶2 000）1 h，再用TBST洗膜4次，每次10 min。用ECL孵育后在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影拍照，用Image J對圖片進行分析。

2.10 統(tǒng)計學分析 試驗重復3次，所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進行分析，數(shù)值用±s表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 四物湯顯著改善貧血大鼠幼鼠的生長情況 造模2周后，與正常組相比，模型組活動量減少，耳廓和腳趾呈蒼白色，體重顯著降低（P<0.01）。給藥期間，與模型組相比，四物湯各組的活動量增多，耳廓和腳趾色澤紅潤，見圖1，2。與模型組相比，給藥12 d后，四物湯16 g·kg^-1組的體重顯著升高（P<0.05），給藥16 d后，四物湯4，8 g·kg^-1組的體重均顯著升高（P<0.05），見圖3。

3.2 四物湯顯著改善貧血大鼠幼鼠紅細胞形態(tài) 與正常組相比，模型組的紅細胞數(shù)量減少，體積變小，中央淡染區(qū)擴大。與模型組相比，四物湯各組的紅細胞數(shù)量增多，體積變大，中央淡染區(qū)縮小，見圖4。

3.3 四物湯顯著改善貧血大鼠幼鼠肝臟外觀和組織形態(tài) 與正常組相比，模型組肝臟呈淺紅色，中央靜脈周圍的肝細胞索分界不清晰，排列雜亂。與模型組相比，四物湯各組肝臟顏色逐漸變紅，中央靜脈周圍的肝細胞索分界較清晰，排列趨于整齊，見圖5，6。

3.4 四物湯顯著改善貧血大鼠幼鼠血常規(guī)相關(guān)指標 與正常組相比，模型組的紅細胞數(shù)量（RBC），血紅蛋白含量（Hb），紅細胞比容（HCT），平均紅細胞體積（MCV），平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）和平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）均顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，四物湯4，8，16 g·kg^-1組的RBC，Hb，HCT和MCHC均顯著升高（P<0.05，P<0.01）；8，16 g·kg^-1組的MCV和MCH均顯著升高（P<0.05，P<0.01）。見表1，2。

3.5 四物湯顯著改善貧血大鼠幼鼠血清鐵、總鐵結(jié)合力和血清鐵蛋白含量 與正常組相比，模型組的血清鐵和血清鐵蛋白含量均顯著降低（P<0.01），總鐵結(jié)合力顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，四物湯4 g·kg^-1組的血清鐵蛋白顯著升高（P<0.05）；8 g·kg^-1組的血清鐵蛋白顯著升高，總鐵結(jié)合力顯著降低（P<0.05）；16 g·kg^-1組的血清鐵和血清鐵蛋白均顯著升高（P<0.01），總鐵結(jié)合力顯著降低（P<0.05），見表3。

3.6 四物湯顯著改善貧血大鼠幼鼠肝臟鐵含量和肝臟鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1的表達 與正常組相比，模型組的肝臟鐵含量和肝臟鐵蛋白表達均顯著降低（P<0.01）；轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達均顯著升高（P<0.05，P<0.01）。與模型組相比，四物湯4，8，16 g·kg^-1組的肝臟鐵含量均顯著升高（P<0.05，P<0.01）；四物湯8，16 g·kg^-1組的肝臟鐵蛋白表達均顯著升高（P<0.01），轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1表達均顯著降低（P<0.05，P<0.01），見表4，圖7。

3.7 四物湯顯著降低貧血大鼠幼鼠血清鐵調(diào)素和肝臟鐵調(diào)素含量 與正常組相比，模型組的血清鐵調(diào)素和肝臟鐵調(diào)素均顯著升高（P<0.05，P<0.01）。與模型組相比，四物湯4，8，16 g·kg^-1組的血清鐵調(diào)素均顯著降低（P<0.05，P<0.01）；四物湯8，16 g·kg^-1組的肝臟鐵調(diào)素均顯著降低（P<0.05），見表5。

4 討論

4.1 缺鐵性貧血的治療手段有待提高 缺鐵性貧血是指缺鐵引起的小細胞低色素性貧血及相關(guān)的缺鐵異常。嬰幼兒需鐵量較大，常因添加輔食不當造成缺鐵性貧血。青少年偏食也易致缺鐵性貧血^[2]?？诜F劑是治療缺鐵性貧血的首選方式，但是目前在口服鐵劑治療或預(yù)防缺鐵性貧血的用藥劑量、用藥時間和停藥時間等方面存在較多爭議^[12]。臨床上使用的口服鐵劑主要有琥珀酸亞鐵，硫酸亞鐵等，這些亞鐵類補鐵劑都會對嬰幼兒產(chǎn)生較為嚴重的消化道反應(yīng)，如惡心，便秘，腹瀉，腹部不適和口腔異味等^[13]。并且，若補充鐵劑過量，又可能引起鐵超載，導致氧化應(yīng)激，增加慢性病的危險^[14]。因此，尋找新的治療缺鐵性貧血的藥物很有必要。

4.2 補血名方四物湯改善貧血的作用機制與調(diào)節(jié)鐵代謝有關(guān) 四物湯作為經(jīng)典的中醫(yī)補血方劑，具有補血調(diào)血的功用，主治營血虛滯證。早在20世紀90年代初，龔躍新等^[15]就對四君子湯、四物湯和八珍湯中的微量元素進行了測定，結(jié)果表明四物湯中的含鐵量最高，這為缺鐵性貧血患者增加了鐵的來源。但同時他們也指出，四物湯補血的功效并不僅僅是通過補充鐵元素，而是多種作用協(xié)同的結(jié)果。四物湯的有效成分主要包括多糖、阿魏酸、川芎嗪和芍藥苷等^[16]，有研究^[17]發(fā)現(xiàn)，當歸多糖與高價鐵形成復合物后，可以升高缺鐵性貧血大鼠RBC，Hb，HCT和全血鐵含量。當歸多糖還可以抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白和鐵調(diào)素的表達^[18]，提示四物湯可能具有調(diào)節(jié)鐵代謝的作用。本研究首次證明了四物湯具有較好的治療幼鼠缺鐵性貧血的作用，并證明了能顯著糾正由于機體功能狀態(tài)鐵丟失時造成的血清鐵降低和總鐵結(jié)合力升高。另一方面，鐵蛋白是人體鐵儲備的主要形式之一^[19]，轉(zhuǎn)鐵蛋白是機體中轉(zhuǎn)運鐵的重要方式，四物湯可以顯著升高血清鐵蛋白和肝臟鐵蛋白，抑制肝臟轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達，并且可能通過抑制鐵調(diào)素的表達，改善鐵缺乏狀況，對幼鼠缺鐵性貧血模型的鐵代謝紊亂起到顯著的改善作用。

4.3 幼鼠低鐵飼料造模結(jié)果更加接近臨床實際 在本研究中，作者采用21 d斷乳大鼠作為試驗對象，以模擬嬰幼兒缺鐵性貧血。在模型的建立過程中，通過自由飲去離子水盡量減少鐵接觸，并且僅通過低鐵飼料飼喂，未采取放血，盡可能與臨床實際相符。其結(jié)果，模型組活動量減少，體重顯著降低，耳廓和腳趾呈蒼白色，肝臟呈淺紅色，呈小細胞低色素性貧血，血清鐵蛋白顯著降低，有缺鐵的依據(jù)，符合缺鐵性貧血的診斷標準^[2]。

綜上所述，四物湯對幼鼠缺鐵性貧血具有較好的改善作用，并且其對鐵代謝的調(diào)節(jié)可能與鐵調(diào)素有關(guān)，其進一步的機制還有待深入研究。

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[責任編輯 張寧寧]