周 萌 劉保國 顧 靜 苗國英 李小靜 劉 青

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·論著·

Raptor、Rictor和磷酸化Akt在日光性角化病、Bowen病及鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

周 萌1劉保國2顧 靜1苗國英2李小靜2劉 青2

目的： 檢測Raptor、Rictor和磷酸化Akt(p-Akt)在日光性角化病、Bowen病和鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)。方法： 采用免疫組化法檢測Raptor、Rictor及p-Akt(Ser473)在20例正常皮膚、20例日光性角化病、20例Bowen病及40例鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)。結(jié)果： Raptor在鱗狀細(xì)胞癌、Bowen病和日光性角化病中的陽性表達(dá)率分別為87.50%、70.00%和60.00%，均高于正常皮膚的25.00%(均P<0.05)；其中低分化鱗狀細(xì)胞癌中Raptor的陽性表達(dá)率為100%，高于高分化鱗狀細(xì)胞癌的陽性表達(dá)率75%(P<0.05)。Rictor在鱗狀細(xì)胞癌、Bowen病和日光性角化病中的陽性表達(dá)率分別為80.00%、70.00%及55.00%，均高于正常皮膚陽性表達(dá)率的20%(均P<0.05)；p-Akt(Ser473)在鱗狀細(xì)胞癌、Bowen病和日光性角化病中的陽性表達(dá)率分別為77.50%、65.00%及50.00%，而正常皮膚陽性表達(dá)率為0。鱗狀細(xì)胞癌、Bowen病和日光性角化病中Rictor的陽性表達(dá)水平和p-Akt(Ser473)的陽性表達(dá)水平均呈正相關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論： Raptor、Rictor和p-Akt(Ser473)的高表達(dá)可能與日光性角化病、Bowen病和鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

鱗狀細(xì)胞癌； Bowen病； 日光性角化??； Raptor； Rictor

哺乳動物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在感受營養(yǎng)信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與增殖中起著重要作用，其異常活化與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。生物體內(nèi)mTOR主要有mTORC1、mTORC2兩種復(fù)合體，雷帕霉素靶蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(regulatory-associated protein of mammalian target of rapamycin, Raptor)、雷帕霉素不敏感的伴侶蛋白(rapamycin insensitive companion of mTOR, Rictor)分別為mTORC1、mTORC2的關(guān)鍵蛋白，磷酸化Akt的絲氨酸473(Ser473)位點(diǎn)p-Akt(Ser473)可反映mTORC2的活化狀態(tài)。本研究旨在通過檢測日光性角化(Actinic Keratosis，AK)、Bowen病(Bowen's disease，BD)、鱗狀細(xì)胞癌(Squamous cell carcinoma，SCC)中Raptor、Rictor、p-Akt(Ser473)的水平，初步探討其在AK、BD、SCC發(fā)生發(fā)展中的作用與意義，為臨床早期診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月至2015年12月河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚病理室臨床資料完整的患者的石蠟組織標(biāo)本，AK 20例，男9例，女11例，年齡51～75歲，平均(66.61±7.34)歲；BD 20例，男13例，女7例，年齡51～70歲，平均(61.05±6.71)歲；SCC 40例，男22例，女18例，年齡49～75歲，平均(65.06±7.32)歲,其中高分化(I～I(xiàn)I級)20例,低分化(III～I(xiàn)V級)20例?；颊咂p部位均為頭面部，無其他皮膚病或系統(tǒng)性疾病,術(shù)前未經(jīng)激光、光動力等特殊治療。所有標(biāo)本均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)生復(fù)查并明確診斷，重復(fù)病理檢查的病例僅入選首次資料。另選取河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的20例面部正常皮膚作為對照組，男10例，女10例，年齡25～56歲，平均(37.20±9.34)歲。SCC分級[1]：I級：未分化細(xì)胞數(shù)<25%，癌組織向真皮侵犯，不超過汗腺水平；II級：未分化細(xì)胞數(shù)25%～50%，癌組織到達(dá)真皮層；III級：未分化細(xì)胞數(shù)50%～75%，角化不明顯，胞核不典型；IV級：未分化細(xì)胞數(shù)>75%，癌細(xì)胞幾乎全為非典型鱗狀細(xì)胞。

1.2 主要試劑 兔抗人Raptor多克隆抗體(英國Abcam公司)工作濃度為1∶50；兔抗人Rictor單克隆抗體(英國Abcam公司)工作濃度為1∶500；兔抗人p-Akt(Ser473)單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology 公司)工作濃度為1∶50；PV-9001試劑盒、DAB酶底物試劑盒及PBS購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 石蠟標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化聚合物酶標(biāo)二抗法，行pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液92℃水浴15分鐘修復(fù)抗原，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。正常皮膚作為對照，PBS代替一抗作為空白對照。實(shí)驗(yàn)分組：正常皮膚組、AK組、BD組、SCC組。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 光鏡下觀察染色陽性物質(zhì)為黃色、棕黃色或者棕褐色顆粒狀物質(zhì)。計(jì)數(shù)方法:每張切片均隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野(×400),計(jì)算出陽性細(xì)胞的平均百分率(陽性細(xì)胞數(shù)/全視野細(xì)胞數(shù))作為每例標(biāo)本陽性表達(dá)率的判定依據(jù)。結(jié)果判定采用二級計(jì)分法,按陽性細(xì)胞的百分比分級:<25%為0分,25%～50%為1分,51%～75%為2分,>75%為3分；按染色強(qiáng)度分級:無色為0分,淺黃色為1分,黃色或黃褐色為2分,棕褐色或褐色為3分。兩級計(jì)分相加計(jì)算總得分,可分為四個(gè)等級:0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+),4～5分為中度陽性(++),6分為強(qiáng)陽性(+++),計(jì)算陽性表達(dá)率時(shí),總得分≥2判定為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，陽性率之間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。Spearman秩相關(guān)分析比較Rictor和p-Akt(Ser473)之間的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Raptor在SCC、BD、AK和正常皮膚中的表達(dá) Raptor在細(xì)胞中的陽性表達(dá)主要為胞質(zhì)染色。35例(87.50%)SCC中Raptor呈陽性表達(dá)，且染色強(qiáng)度多為中度陽性或強(qiáng)陽性(圖1a)；14例(70.00%)BD為陽性表達(dá)，多為弱陽性及中度陽性(圖1b)；12例(60.00%)AK為陽性表達(dá)，多呈弱陽性(圖1c)，正常皮膚中僅5例(25.00%)陽性表達(dá)，呈弱陽性(圖1d)。SCC中Raptor陽性表達(dá)率高于AK、正常皮膚(Fisher確切概率法P<0.05；χ2=23.438，P<0.05)；BD、AK中Raptor陽性表達(dá)率均高于正常皮膚，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ12=8.120，P<0.05；χ22=5.013，P<0.05)；低分化SCC高于高分化SCC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher確切概率法P<0.05)；SCC與BD、BD與AK相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 Raptor在日光性角化、Bowen病、鱗狀細(xì)胞癌和正常皮膚中的表達(dá) 例

注:a與正常皮膚比較，P<0.05;b與日光性角化比較，P<0.05;c與高分化鱗狀細(xì)胞癌比較，P<0.05

2.2 Rictor在SCC、BD、AK和正常皮膚中的表達(dá) Rictor在細(xì)胞中的陽性表達(dá)主要為胞質(zhì)染色。32例(80.00%)SCC中Rictor呈陽性表達(dá)，其中癌巢中央陽性表達(dá)較少，邊緣表達(dá)較多(圖2a)；14例(70.00%)BD為陽性表達(dá)，多呈中度陽性或弱陽性(圖2b)；11例(55.00%)AK為陽性表達(dá)，多呈中度陽性表達(dá)(圖2c)；正常皮膚中僅4例(20.00%)呈弱陽性表達(dá)(圖2d)。SCC中Rictor陽性表達(dá)率高于AK、正常皮膚，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ12=4.104,P<0.05;χ22=20.000,P<0.05);BD、AK中Rictor陽性表達(dá)率均高于正常皮膚，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ12=10.101,P<0.05;χ22=5.227,P<0.05)；低分化SCC與高分化SCC、SCC與BD、BD與AK相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 Rictor在日光性角化、Bowen病、鱗狀細(xì)胞癌和正常皮膚中的表達(dá) 例

注:a與正常皮膚相比，P<0.05;b與日光性角化相比，P<0.05

2.3 p-Akt(Ser473)在SCC、BD、AK和正常皮膚中的表達(dá) p-Akt(Ser473)在細(xì)胞中的陽性表達(dá)主要為胞質(zhì)染色。31例(77.50%)SCC中p-Akt(Ser473)呈陽性表達(dá)(圖3a)；13例(65.00%)BD為陽性表達(dá)(圖3b)；10例AK(50.00%)為陽性表達(dá)，呈中度陽性或弱陽性表達(dá)(圖3c)；正常皮膚中無陽性表達(dá)，僅在基底層呈極低的局灶性弱表達(dá)(圖3d)。SCC中p-Akt(Ser473)陽性表達(dá)率高于AK、正常皮膚，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ12=4.660,P<0.05；χ22=32.069,P<0.05)；BD、AK中p-Akt(Ser473)的陽性表達(dá)率均高于正常皮膚(χ12=19.259,P<0.05;χ22=13.333,P<0.05)；p-Akt(Ser473)在低分化SCC與高分化SCC、SCC與BD、BD與AK相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 p-Akt(Ser473)在日光性角化、Bowen病、鱗狀細(xì)胞癌和正常皮膚中的表達(dá) 例

注:a與正常皮膚相比，P<0.05;b與日光性角化相比，P<0.05

2.4 Rictor與p-Akt的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)分析表明，AK、BD、SCC中Rictor的陽性表達(dá)水平和p-Akt(Ser473)的陽性表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.503,P<0.05;r=0.663,P<0.05;r=0.629,P<0.05)。

圖1 Raptor的表達(dá)(免疫組化，×200):1a鱗狀細(xì)胞癌；1b Bowen?。?c日光性角化；1d正常皮膚 圖2 Rictor的表達(dá)(免疫組化，×200):2a鱗狀細(xì)胞癌；2b Bowen病；2c日光性角化；2d正常皮膚 圖3 p-Akt(Ser473)的表達(dá)(免疫組化，×200):3a鱗狀細(xì)胞癌；3b Bowen??；3c日光性角化；3d正常皮膚

3 討論

SCC系起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一種惡性腫瘤,發(fā)病率在皮膚惡性腫瘤中位居第二，具有侵襲性較高，對組織破壞性較大等特點(diǎn)[1]。BD是一種表皮內(nèi)鱗狀細(xì)胞癌，又稱原位鱗狀細(xì)胞癌，約3%～5%，也有認(rèn)為高達(dá)20%～30%患者可演變?yōu)榍忠u癌[1]。AK是長期日光暴露所引起的一種癌前期病變，約0.01%～0.3%可轉(zhuǎn)變?yōu)镾CC[1]。

mTOR被認(rèn)為參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且可能成為抗癌藥物發(fā)展的重要靶點(diǎn)[2]。其復(fù)合體mTORC1、mTORC2的組織結(jié)構(gòu)不同，功能也有所差別。mTORC1可被雷帕霉素所抑制，其主要通過磷酸化下游靶蛋白S6激酶1(70 kDa ribosomal protein S6 kinase，S6K1/p70S6K)及真核啟動因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor-4E-binding protein 1，4EBP1)來調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)翻譯。mTORC1對蛋白質(zhì)合成的影響被認(rèn)為與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其能夠感受生長因子、能量狀態(tài)、氨基酸等細(xì)胞內(nèi)外的多種因素，從而調(diào)控細(xì)胞合成和分解代謝過程,它的異常激活將促進(jìn)一系列與細(xì)胞生長、增殖和分化相關(guān)蛋白的合成增加,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[3,4]。除此之外，mTORC1介導(dǎo)的脂質(zhì)合成和自噬也可能參與了腫瘤形成[3]。本研究結(jié)果顯示Raptor在正常皮膚細(xì)胞質(zhì)中少量表達(dá)，在AK、BD中表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在SCC中，尤其是低分化SCC細(xì)胞質(zhì)中則高表達(dá)，提示Raptor不僅在AK、BD、SCC中存在異?；罨?同時(shí)也可能與腫瘤的惡性程度及分化程度相關(guān)，此結(jié)果與張洪旺等[5]在膠質(zhì)瘤中的研究一致。這為mTORC1在AK、BD、SCC中的活化提供了新的證據(jù)。

mTOR另一復(fù)合體mTORC2則通過作用于Akt，PKCα和SGK1等來調(diào)控多項(xiàng)生命活動，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞骨架重建、細(xì)胞遷移、蛋白質(zhì)翻譯和修飾等[3,6]。Guertin[7]研究發(fā)現(xiàn)在PTEN缺陷的小鼠中,Rictor是前列腺癌細(xì)胞和實(shí)體瘤生長所必須的。mTORC2可能參與了腫瘤細(xì)胞運(yùn)動和轉(zhuǎn)移，其影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲潛能[8]。通過沉默Rictor的表達(dá)降低mTORC2的活性能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[9,10]。Carr[11]等認(rèn)為， Rictor對正常表皮增殖并不是必須的，但其與皮膚腫瘤的生成與發(fā)展密切相關(guān)，抑制Rictor可延緩皮膚腫瘤的發(fā)展。本文研究顯示Rictor在AK、BD、SCC中的表達(dá)均高于正常皮膚，說明Rictor的表達(dá)上調(diào)參與了AK、BD、SCC的發(fā)生發(fā)展，其在SCC癌巢邊緣的表達(dá)強(qiáng)于中央部位，由于癌巢周邊的腫瘤細(xì)胞容易侵襲和轉(zhuǎn)移，提示Rictor可能參與SCC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。Akt是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，當(dāng)其蘇氨酸-473位點(diǎn)被磷酸化時(shí)可被部分激活。p-Akt(Ser473)可反映mTORC2活化狀態(tài)，其可通過滅活多種凋亡效應(yīng)分子、調(diào)控細(xì)胞周期、激活端粒酶活性、促進(jìn)血管生成和遷移相關(guān)程序等途徑而促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲[12]。本文結(jié)果顯示p-Akt(Ser473)在SCC、BD、AK中的表達(dá)水平均高于正常皮膚，SCC中表達(dá)水平又高于AK，這與連昕等[13]報(bào)道相符。p-Akt(Ser473)的不同程度表達(dá)水平與Rictor的表達(dá)水平呈正相關(guān)，表明在AK、BD、SCC中mTORC2參與了Akt的Ser473位點(diǎn)活化。

以上結(jié)果表明，Raptor、Rictor和p-Akt(Ser473)共同參與了AK、BD、SCC的發(fā)生和發(fā)展，所起的作用可能不同，其具體機(jī)制值得進(jìn)一步的研究。國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)作為mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素可以抑制皮膚鱗癌細(xì)胞A431、Colo-16的增殖[14,15]，使細(xì)胞增殖停止在G1期，發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法證實(shí)了Raptor在SCC中高表達(dá)，進(jìn)一步表明雷帕霉素可能有治療SCC的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示Rictor、p-Akt(Ser473)在SCC中呈高表達(dá)狀態(tài)，且兩者具有正相關(guān)性，提示抑制mTORC2可能對SCC也有一定的殺傷作用，由于mTORC2結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，單獨(dú)mTORC2抑制劑的發(fā)現(xiàn)還存在一定的困難性[16]，但mTORC1/2共同的抑制劑目前已應(yīng)用于乳腺癌、白血病的體外試驗(yàn)中[10,17]，且較雷帕霉素顯示出更強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞作用，其在SCC中是否也有類似治療效果還有待更一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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(收稿：2016-10-07 修回：2016-10-10)

Expression of Raptor, Rictor and p-Akt in actinic keratosis, Bowen's disease and squamous cell carcinoma

ZHOUMeng1,LIUBaoguo2,GUJing1,MIAOGuoying2,LIXiaojing2,LIUQing2.

1.PostgraduateSchool,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China; 2.DepartmentofDermatology,theHospitalAffiliatedtoHebeiEngineeringUniversity,Handan056002,China

LIUBaoguo,E-mail:lbg66@163.com

Objective:To detect the expression of Raptor, Rictor and p-Akt in the lesions of actinic keratosis (AK), Bowen's disease (BD) and squamous cell carcinoma (SCC). Methods: Immunohistochemistry was used to detect the expression of Raptor, Rictor, p-Akt (Ser473) in the tissue samples from the patients with AK, BD, SCC and normal human skin. Results: The positivity rates of Raptor in SCC, BD and AK were 87.50%, 70.00% and 60.00%, which was significantly higher than that in normal skin (Ps<0.05). The positivity rate was 100% in poorly differentiated squamous cell carcinoma and 75% in well differentiated squamous cell carcinomas, with a significant difference (P<0.05). The positivity rates of Rictor in SCC, BD and AK were 80.00%, 70.00% and 55.00%, which was significantly higher than that in normal skin (P<0.05). The positivity rates of p-Akt (Ser473) in SCC, BD and AK were 77.50%, 65.00% and 50.00%, while there was no positive staining in normal skin. There was a positive correlation between the expression level of Rictor and p-Akt (Ser473) in SCC, BD and AK (P<0.05). Conclusion: The high expression of Raptor, Rictor and p-Akt (Ser473) may play a key role in the occurrence and development of AK, BD and SCC.

Squamous cell carcinoma; Bowen's disease; actinic keratosis; Raptor; Rictor

河北省政府資助臨床優(yōu)秀人才培訓(xùn)項(xiàng)目(編號：361037) 邯鄲市科技技術(shù)研究項(xiàng)目(編號：1523108076)

1承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北承德,067000 2河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲,056002

劉保國，E-mail：lbg66@163.com