李永蓮,劉文鋒,陽元娥,周亮,黎彧

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；五邑大學(xué)，廣東 江門 529020）

微生物法降解玉米芯制備燃料乙醇的研究

李永蓮,劉文鋒,陽元娥,周亮,黎彧

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；五邑大學(xué)，廣東 江門 529020）

研究微生物法酶解玉米芯的最佳工藝和酵母菌發(fā)酵的最佳工藝。方法：采用自篩微生物L(fēng)2″對玉米芯進行酶解，酵母對酶解液進行發(fā)酵。結(jié)果：酶解條件：自篩微生物L(fēng)2″用量30m L pH值為7.0，溫度35℃，酶解時間48h，還原糖濃度達到最高；發(fā)酵條件：酵母接種量40m L，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時間36 h，酒精產(chǎn)量最高。結(jié)論：自篩微生物L(fēng)2″適合用以酶解玉米芯，在較佳的酶解和較佳的發(fā)酵條件下，可顯著提高酶解率和發(fā)酵率。

玉米芯；微生物法；酶解；發(fā)酵

隨著世界經(jīng)濟的全面發(fā)展，人類將需要越來越多的能源。因為化石能源是不可再生的，其儲存量將越來越少，將會面臨短缺危機；且化石能源污染環(huán)境，因此可再生能源的開發(fā)利用將越來越受到重視。燃料乙醇因環(huán)保無污染，并支持汽油充分燃燒，受到越來越多的關(guān)注。我國玉米年產(chǎn)量居世界第二，但是大量玉米芯因無法利用被廢棄而造成極大的浪費。如果利用玉米芯制備燃料乙醇，則環(huán)保又經(jīng)濟，具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益[1]。本文采用玉米芯為原料，研究利用自篩的微生物對其進行降解及發(fā)酵制備乙醇的技術(shù)路線，以探究玉米芯進行發(fā)酵燃料乙醇的可行性和經(jīng)濟性，為玉米芯的綜合利用提供理論依據(jù)。

一、材料和方法

（一）材料

玉米芯購自廣西桂林，曬干、粉碎、過60目篩、恒重，置樣品袋中儲存?zhèn)溆肹2]；微生物菌L2"是廣東工業(yè)大學(xué)天然藥物與綠色化學(xué)研究所培養(yǎng)篩選得到；釀酒酵母購買自安琪酵母股份有限公司。

（二）培養(yǎng)基

微生物菌L2″活化培養(yǎng)基，即是PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂16g，蒸餾水1000m L。酵母活化培養(yǎng)基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000m L。

（三）菌種制備

微生物菌L2″以PDA斜面于4℃儲藏，在微生物法預(yù)處理玉米芯前，接種到PDA液體培養(yǎng)基，置于35℃培養(yǎng)24h，菌絲長滿液面。預(yù)處理時，將長滿菌絲的液體接種到每個樣品[3]。

釀酒酵母S.cerevi si ae，利用安琪釀酒高活性干酵母培養(yǎng)，以PDA斜面于4℃保存，在發(fā)酵制備乙醇前，接種到酵母活化液體培養(yǎng)基中活化。

（四）實驗方法

稱取已恒重的玉米芯樣品10.0g，按固液比1：12加入1.0%（質(zhì)量分數(shù)）稀H 2SO 4，設(shè)置2個重復(fù)實驗，放置濕熱高壓滅菌鍋在121℃的溫度下預(yù)處理1h，自然冷卻至室溫，用稀N aO H溶液調(diào)節(jié)pH 4.8～5.0，過濾。預(yù)處理后，在玉米芯水解液中加入自篩選培養(yǎng)的微生物菌L2"，放置溫控搖床，設(shè)置一定溫度和轉(zhuǎn)速進行酶解。酶解后，加入釀酒酵母S. cerevi si ae發(fā)酵液，放置于溫控搖床，設(shè)置一定的溫度和轉(zhuǎn)速進行發(fā)酵[4]。

（五）測定方法

還原糖含量測定：3，5-二硝基水楊酸法(DN S法)[5]；乙醇含量測定：氣相色譜法（GC）。

二、實驗內(nèi)容

（一）微生物酶解的影響因素研究

1、菌用量

預(yù)處理后，加入24h活化的L2〞微生物菌液10、20、30、40、50m L，設(shè)計2個重復(fù)，調(diào)節(jié)pH至7.0，置于35℃、100rad/m i n恒溫搖床中培養(yǎng)48h。

2、溫度

預(yù)處理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，設(shè)計2個重復(fù)，調(diào)節(jié)pH至7.0，分別置于不同溫度：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，100rad/m i n的恒溫搖床中培養(yǎng)48h。

3、pH值

預(yù)處理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，設(shè)計2個重復(fù)，調(diào)節(jié)不同的pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，然后置35℃，100rad/m i n的恒溫搖床中培養(yǎng)48h。

4、時間

預(yù)處理后，加入24h活化的微生物菌L2〞30m L，設(shè)計2個重復(fù)，調(diào)節(jié)pH至7.0，置于35℃，100rad/m i n的恒溫搖床中培養(yǎng)60h，每隔4h取樣2.0m L。

（二）發(fā)酵的影響因素研究

1、酵母接種量

酶解液中，分別加入20、30、40、50、60、70m L活化后的釀酒酵母S.cerevi si ae發(fā)酵液，密封，置于恒溫搖床，在35℃、100rad/m i n下發(fā)酵36h后停止，精餾發(fā)酵液，采用氣相色譜法檢測乙醇產(chǎn)量[6]。

2、溫度

在酶解液中加入40m L活化后的釀酒酵母S. cerevi si ae發(fā)酵液，密封，置于恒溫搖床，設(shè)置發(fā)酵溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，在轉(zhuǎn)速100rad/m i n下發(fā)酵36h后停止，精餾發(fā)酵液，采用氣相色譜法檢測乙醇產(chǎn)量[6]。

3、時間

在酶解液中加入活化后的釀酒酵母S. cerevi si ae發(fā)酵液40m L，密封，置于恒溫搖床，在35℃、100rad/m i n下分別發(fā)酵12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h停止，精餾發(fā)酵液，采用氣相色譜法檢測乙醇產(chǎn)量[6]。

三、結(jié)果與討論

（一）微生物酶解的影響因素

1、菌用量的影響

降解生物質(zhì)的活性物質(zhì)主要是纖維素酶，但是目前纖維素酶的價格較高，因此目前制備燃料酒精的酶解過程關(guān)鍵環(huán)節(jié)是降低纖維素酶的成本[6]。研究了自篩微生物L(fēng)2〞產(chǎn)生纖維素酶后進行玉米芯酶解效果的研究及最佳用量的研究。如圖1所示，自篩微生物L(fēng)2〞進行玉米芯酶解產(chǎn)生了較佳的效果，玉米芯的酶解開始隨著菌用量的增加而加快。但是當(dāng)菌用量到30m L時，繼續(xù)增大菌用量時酶解效果反而使還原糖濃度下降，原因可能是當(dāng)在底物玉米芯用量一定的情況下，菌用量的增加有利于玉米芯酶解為還原糖，但是水解玉米芯也要消耗一部分還原糖以滿足微生物代謝需要，所以當(dāng)微生物量過大，單位時間內(nèi)微生物自身代謝消耗的還原糖量超過其酶解玉米芯得到的還原時，還原糖含量開始下降。因此自篩微生物L(fēng)2〞酶解玉米芯的效果是明顯的，其最佳菌用量為30m L。

圖1 菌用量對微生物酶解的影響Fig.1 The effect of dosages

2、溫度的影響

溫度的變化影響微生物的生產(chǎn)速度、酶活力和酶促反應(yīng)速率，溫度過高或者過低都會導(dǎo)致微生物不生長甚至死亡，酶活力和酶促反應(yīng)速率降低甚至被破壞，所以需要尋找微生物的最適溫度。如圖2所示，自篩選微生物的最適生長溫度為35℃，此時還原糖的含量較高。當(dāng)溫度過低時微生物生長緩慢，分解的纖維素酶較少，導(dǎo)致還原糖含量低；溫度過高則微生物生長會受到抑制或?qū)е滤劳?，?dǎo)致還原糖含量下降。

圖2 溫度對微生物酶解的影響Fig.2 The effect of temperature

3、pH值的影響

pH值的變化會影響微生物的生命活動、代謝過程酶活性。微生物都有最適pH值和一定的pH范圍，在最適范圍內(nèi)生長速率最快，酶活性最高，催化作用最強；過酸過堿會導(dǎo)致微生物的生長受阻，甚至死亡。如圖3所示，微生物L(fēng)2〞的最適pH為7.0，此時還原糖濃度最高。

圖3 pH值對微生物酶解的影響Fig.3 The effect of pH

4、時間的影響

如圖4所示，酶解時間增加，微生物充分接觸玉米芯，還原糖濃度增大，48h時還原糖量最大，而后還原糖的濃度不會再隨著酶解時間的延長而增加，反而略有降低。分析其原因可能主要有兩點：（1）微生物與底物玉米芯的結(jié)合在一定的酶促時間達到飽和[6]；（2）微生物分解纖維素酶的能力隨著時間的增加而降低。

圖4 時間對微生物酶解的影響Fig.4 The effect of time

（二）發(fā)酵過程的影響因素

1、酵母接種量的影響

如圖5所示，在開始的一段時間，隨著酵母接種量的增加，酒精的產(chǎn)量增大；但是當(dāng)酵母接種量到40m L后，酵母接種量的增加反而使得酒精的產(chǎn)量減少。其原因[7]可能是：（1）酵母接種量過大時，酵母菌的生長消耗了大量的還原糖；（2）產(chǎn)物酒精的增多抑制酵母發(fā)酵。

圖5 酵母接種量對發(fā)酵的影響Fig.5 The effect of yeast dosages

2、溫度的影響

溫度對酵母菌的生長和發(fā)酵有關(guān)鍵作用。由圖6可知，隨著溫度的升高，酒精的產(chǎn)量增大，35℃最高，溫度繼續(xù)升高產(chǎn)量反而降低，可知35℃為最適的發(fā)酵溫度。原因可能是：（1）酵母的生長和發(fā)酵有最適溫度，過高或者過低都不利于酵母作用；（2）溫度過高導(dǎo)致乙醇揮發(fā)以致不能收集。

圖6 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響Fig.6 The effect of fermentation temperature

3、時間的影響

由圖8可見，發(fā)酵時間在36h左右時，酒精產(chǎn)率達到最高值，繼續(xù)延長發(fā)酵時間后呈平緩趨勢，甚至慢慢降低。其原因可能有：當(dāng)酒精濃度達到一定時，酵母生長受到抑制，導(dǎo)致酒精增加緩慢，繼續(xù)發(fā)酵，部分乙醇因揮發(fā)而導(dǎo)致產(chǎn)率略有下降。

圖7 時間對發(fā)酵的影響Fig.7 The effect of time

四、結(jié)論

(一)酶解最佳條件：自篩微生物L(fēng)2〞適合用于酶解玉米芯，其用量最適為30m L，pH值最適為7.0左右，溫度最適為35℃，酶解時間最適為48h，在這樣的條件下，還原糖的濃度達到最高。

(二)發(fā)酵最佳條件：釀酒酵母S.cerevi si ae發(fā)酵液接種量最適為40m L，發(fā)酵溫度最適為35℃，發(fā)酵時間最適為36h，酒精產(chǎn)量最高可達0.42g/g葡萄糖，與理論值0.51 g/g葡萄糖相比較，產(chǎn)率達到82.3%，這與文獻[6]的研究成果基本是一致的。

[1]李永蓮.玉米芯預(yù)處理工藝及制備燃料酒精的研究[D].廣州：廣東工業(yè)大學(xué)，2011.

[2]馬曉軒，范代娣，馬沛等.秸稈微生物降解及發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，39（1）：71-74.

[3]阮奇城，祁建民，胡開輝等.白腐真菌Pleurotus sajor-caju預(yù)處理對紅麻秸稈發(fā)酵乙醇的影響[J].生物工程學(xué)報，2011,27（10）：1464-1471.

[4]李永蓮，張焜，趙肅清.玉米芯稀硫酸預(yù)處理后酶解及酒精制備研究[J].釀酒科技，2011，（04）：17-19.

[5]宋占午,壬萊,劉艷玲.3,5-二硝基水楊酸測定還原糖含量的條件考察[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1997，(33)：52-55.

[6]李永蓮，劉文鋒，陽元娥.酶法降解玉米芯以制備燃料乙醇的研究[J].廣東技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報，2014，（07）：：4-51.

[7]Nobuhiro Nakamura,Ryosuke Yamada,Satoshi Katahira. Effective xylose/cellobiose co-fermentation and ethanol productionbyxylose-assimilatingS.cerevisiaevia expression of?-glucosidase on its cell surface[J].Enzyme and Microbial Technology,2008(43)：233-236.

TU741

A

1671-5993（2017）01-0067-04

2016-11-1

廣州市科技局項目：高檔羽絨殺菌除臭綠色新工藝的研究（201510010170）

李永蓮（1985-），女，廣東韶關(guān)人，工程師，工學(xué)碩士，主要研究生物資源的利用與開發(fā)。