蠟樣芽孢桿菌分型方法研究進(jìn)展

曹飛揚(yáng)，王 娉，江連洲，陳 穎,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京 100176；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蠟樣芽孢桿菌分型方法研究進(jìn)展

曹飛揚(yáng)1,2，王 娉1，江連洲2，陳 穎1,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京 100176；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蠟樣芽孢桿菌是一種食源性條件致病菌，在環(huán)境和食品中分布比較廣泛， 所引起的食物中毒常分為腹瀉型和嘔吐型。研究蠟樣芽孢桿 菌的分型方法對(duì)該菌的預(yù)防、預(yù)警、溯 源及分子流行病學(xué)的調(diào)查都具有重要意義。目前，蠟樣芽孢桿菌的分型方法主要包括噬菌體分型、生化分型等傳統(tǒng)分型方法以及多位點(diǎn)序列分型、重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分型、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型等分子分型方法。以蠟樣芽孢桿菌為對(duì)象，綜述其分型方法的研究進(jìn)展，以期為該菌的分型提供一定參考。

蠟樣芽孢桿菌；傳統(tǒng)分型；分子分型

曹飛揚(yáng), 王娉, 江連洲, 等. 蠟樣芽孢桿菌分型方法研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 286-290. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201717046. http://www.spkx.net.cn

CAO Feiyang, WANG Ping, JIANG Lianzhou, et al. Advances in methods for Bacillus cereus typing[J]. Food Science, 2017, 38(17): 286-290. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717046. http://www.spkx.net.cn

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是革蘭氏陽(yáng)性菌，兼性需氧，隸屬于芽孢桿菌屬。B. cereus呈長(zhǎng)桿狀，大小為（1.0～1.2） μm×（3.0～5.0 ）μm，產(chǎn)圓形或橢圓形的芽孢。在普通培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)成直徑為3～8 mm的白色菌落，該菌落為圓形或近似圓形、稍有光澤、質(zhì)地較軟；在甘露醇卵黃多黏菌素（mannitol-egg-yolkpolymyxin，MYP）瓊脂上呈現(xiàn)微粉紅色菌落，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)[1]。B. cereus的生化特點(diǎn)是不發(fā)酵甘露糖、阿拉伯糖、木糖，厭氧條件下可以發(fā)酵葡萄糖，通常能把明膠液化，產(chǎn)酪蛋白酶、卵磷脂酶、青霉素酶和過(guò)氧化氫酶。B. cereus能合成青霉素酶，對(duì)青霉素有很強(qiáng)的抗性，且該菌有很強(qiáng)的耐熱性，它游離的芽孢在100 ℃條件下至少30 min才能被殺死。據(jù)相關(guān)報(bào)道，乳制品中還存 在一些耐低溫的B. cereus，在冷藏溫度甚至更低溫度條件下仍然可以生長(zhǎng)繁殖，引起食物中毒[2]。

B. cereus在水、空氣、土壤中廣泛存在，因此，食品很容易受到該菌的污染，幾乎所有種類的食品都曾檢出過(guò)蠟樣芽孢桿菌，例如各種類型的乳制品、糧食、肉制品、海產(chǎn)品及蔬菜水果等[3-4]。B. cereus是動(dòng)物及植物源性食品的主要污染物，其引起的食品中毒事件在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，中毒后可以導(dǎo)致胃腸功能紊亂、各種局部或全身性感染，如壞死性腸炎、肝功能衰竭、菌血癥和腦膜炎[5-7]，但其最為常見(jiàn)的是導(dǎo)致腹瀉型和嘔吐型2 種類型的食物中毒，其中腹瀉是由溶血素BL（Hbl）、非溶血性腸毒素（Nhe）、細(xì)胞毒素K（CytK）、腸毒素FM（EntFM）及腸毒素T（BecT）等腸毒素所引起的；嘔吐是由一種小的環(huán)狀熱穩(wěn)定十二肽毒素Ereulide引起的[8]。

病原菌的鑒定和分型對(duì)現(xiàn)代公共衛(wèi)生傳染病監(jiān)測(cè)和疫情應(yīng)對(duì)至關(guān)重要，及時(shí)、準(zhǔn)確的菌株分型數(shù)據(jù)有助于快速檢測(cè)到疾病爆發(fā)源，從而可以采取一定的控制措施，防止未來(lái)病原菌的爆發(fā)[9]。B. cereus的傳統(tǒng)分型方法主要有生化分型、噬菌體分型、血清分型等，但存在操作繁瑣、分型周期長(zhǎng)、分辨率低等缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，B. cereus的分子分型方法越來(lái)越多，如多位點(diǎn)序列分型、重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）分型、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型等，這些分型方法有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分型方法的不足。目前，B. cereus分型的研究處于起步階段，本文對(duì)B. cereus分型方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為該菌的鑒定和分型提供一定的參考。

1 蠟樣芽孢桿菌的傳統(tǒng)分型方法

20世紀(jì)早期，細(xì)菌主要依據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，很難鑒定到種或亞種。為了對(duì)細(xì)菌進(jìn)行細(xì)分，基于血清學(xué)、抗生素敏感性、噬菌體抗性、生化表型等的分型方法逐漸產(chǎn)生[10]。

噬菌體分型是一種基于噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌感染和裂解具有高度特異性而進(jìn)行分型的方法。1988年，姚敬業(yè)等[11]從水中獲取13 株B. cereus噬菌體對(duì)中國(guó)16 個(gè)地區(qū)的121 株食品中毒株及602 株食品分離株進(jìn)行了分型，結(jié)果顯示723 株蠟樣芽孢桿菌被分為41 個(gè)型別，其中型別C20、C30、C24、C27、C19及A4占的比重較大；食品中毒株的分型率為75%，以A4型最多見(jiàn)，明顯高于食品分離株的分型率（51%）。噬菌體分型特異性較高，對(duì)病原菌的溯源具有一定的應(yīng)用價(jià)值，但也存在操作繁瑣、重復(fù)性差、個(gè)別菌株不能分型等不足之處，目前在B. cereus分型中應(yīng)用較少。

目前，傳統(tǒng)生化分型在B. cereus分型中占主要地位，依據(jù)GB 4789.14—2014《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》[1]，通過(guò)明膠液化實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用，可將B. cereus分成15 個(gè)生化型別。李春等[12]于2015年對(duì)各類即食食品中分離的52 株B. cereus進(jìn)行生化分型，結(jié)果表明4 株分離菌株不能分型，其余48 株B. cereus分離菌株分為7 個(gè)型，以2、8、9型為主，通過(guò)與ERIC-PCR分型結(jié)果相比發(fā)現(xiàn)這次實(shí)驗(yàn)的生化分型沒(méi)有分子分型精確。理論上，生化分型可以為B. cereus的溯源提供一定的依據(jù)，但其操作復(fù)雜、所需試劑繁多、分型時(shí)間長(zhǎng)，且有些菌株不能分型。

2 蠟樣芽孢桿菌的分子分型方法

2.1 多位點(diǎn)序列分型

多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是近年來(lái)發(fā)展比較迅速的分子分型方法，分辨能力較高，對(duì)病原體流行病學(xué)及進(jìn)化學(xué)的研究具有重要意義[13]。這種方法通常是選取7 對(duì)管家基因并對(duì)每個(gè)基因450～500 bp的片段進(jìn)行測(cè)序，將每個(gè)位點(diǎn)的序列上傳至MLST網(wǎng)站進(jìn)行分析，獲取相應(yīng)等位基因的編號(hào)，每一株菌的等位基因編號(hào)排列組合構(gòu)成該菌的等位基因圖譜或序列型（sequence typing，ST）[14-16]。MLST技術(shù)可以通過(guò)比較ST評(píng)估不同來(lái)源的菌株之間的親緣關(guān)系，即親緣關(guān)系比較近的菌株ST相同或僅有個(gè)別的基因座存在差異。2007年，Olsen等[17]運(yùn)用改進(jìn)的MLST對(duì)B. cereus群進(jìn)行分型，通過(guò)對(duì)比adk基因片段的核苷酸序列實(shí)現(xiàn)了B. anth racis（炭疽芽孢桿菌）與B. cereus群內(nèi)其他種的區(qū)分，為B. cereus群內(nèi)種間鑒別提供了參考。2014年，劉勇[18]對(duì)大米中分離的13 株嘔吐性B. cereus進(jìn)行了MLST分型，結(jié)果顯示11 株菌株為ST26序列型，這可為產(chǎn)嘔吐毒素B. cereus的初篩提供依據(jù)；并發(fā)現(xiàn)了2 株新的嘔吐性B. cereus序列型，豐富了嘔吐型菌株的多樣性，表明了嘔吐性B. cereus在進(jìn)化過(guò)程中正趨向于多樣化。MLST方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，便于實(shí)驗(yàn)室之前的數(shù)據(jù)比對(duì)分析，有利于追溯病原菌的傳播途徑和來(lái)源，但MLST對(duì)管家基因高度一致的菌株分型并不適合。

2.2 重復(fù)序列PCR分型

重復(fù)序列PCR（repetitive sequence-PCR，Rep-PCR）分型技術(shù)是Versalovic等[19]在1991年發(fā)明的一種基因組指紋分型方法。這種方法是以基因組的重復(fù)序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，最后基于電泳結(jié)果進(jìn)行分型。目前常用于細(xì)菌分型有細(xì)菌基因外重復(fù)回文序列擴(kuò)增（repetitive extragenic palindromic-PCR，REP-PCR）、腸內(nèi)細(xì)菌基因組間重復(fù)序列擴(kuò)增（enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR，ERIC-PCR）和細(xì)菌基因組重復(fù)序列擴(kuò)增（BOX-PCR）等[20-22]。2007年，López等[23]運(yùn)用REPPCR、ERIC-PCR、BOX-PCR 3 種重復(fù)序列PCR方法對(duì)133 株B. cereus蜂蜜分離株進(jìn)行分型，通過(guò)這3 種方法的結(jié)合可以把所有分離菌株分為7 個(gè)型，表明REP-PCR基因組指紋可用于表征B. cereus；這些數(shù)據(jù)也說(shuō)明蜂蜜中分離B. cereus具有高度的基因多樣性，表明B. cereus污染可能來(lái)自花粉、設(shè)備、灰塵等多個(gè)源頭。2011年，Chaves等[24]運(yùn)用REP-PCR對(duì)1980—2000年巴西的97 株食源性B. cereus進(jìn)行分型，結(jié)果分為7 個(gè)主要型別（2 株及以上），表明這些菌株具有高度的基因多樣性，且多樣性隨時(shí)間的推移一直保持；同時(shí)發(fā)現(xiàn)1型包括的菌株最多（10 株菌，9 株相似度為100%），并且這些菌株擁有除ces基因外的所有已知腸毒素相關(guān)基因，這可以為產(chǎn)腸毒素B. cereus的初篩提供參考。REP-PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速，分辨率高，重復(fù)性好，可用于細(xì)菌的多樣性研究，但有關(guān)研究表明，REP-PCR對(duì)相同來(lái)源菌株的分型有局限[25]。

2.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型

隨機(jī)擴(kuò)增 多態(tài)性DNA（random amplifi ed polymorphic DNA，RAPD）分型是一種建立在PCR技術(shù)之上的基因組多態(tài)性檢測(cè)方法。這種方法以基因組DNA為模板，采用隨機(jī)選擇的單一引物擴(kuò)增基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、電泳結(jié)果分析可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的分型[26]。2010年，Thorsen等[27]運(yùn)用RAPD對(duì)非洲發(fā)酵食品中的19 株B. cereus進(jìn)行分型，結(jié)果分為2 個(gè)型，且2型的7 株B. cereus均可以產(chǎn)生嘔吐毒素，說(shuō)明RAPD分型方法可以用于產(chǎn)嘔吐毒素B. cereus的識(shí)別。2012年，Oh等[28]運(yùn)用RAPD對(duì)生米及米飯中分離的B. cereus群進(jìn)行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B. cereus群的生米分離株的多樣性多于B. cereus群的米飯分離株；并且，具有相同RAPD圖譜的B. cereus群分離株一般會(huì)具有相似的毒性，這說(shuō)明RAPD技術(shù)可能適用于B. cereus產(chǎn)毒素種類的判別。Hall等[29]于2012年運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)熱巧克力飲料中的B. cereus群來(lái)源進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B. cereus群最主要的源頭是巧克力粉，同時(shí)機(jī)器部件也是B. cereus群的一個(gè)來(lái)源，這為RAPD技術(shù)在B. cereus群溯源中的應(yīng)用提供了依據(jù)。RAPD技術(shù)在B. cereus分型中的應(yīng)用比較廣泛，相對(duì)于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性、脈沖場(chǎng)凝膠電泳等技術(shù)來(lái)說(shuō)具有簡(jiǎn)單、快速、多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，但RAPD技術(shù)也存在一定的局限性，如穩(wěn)定性和重復(fù)性較差[30]。

2.4 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分型

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分型是基于PCR技術(shù)的基因組限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)方法。該方法是通過(guò)限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，形成大小不同的DNA片段，再用雙鏈寡核苷酸接頭連接酶切片段， 然后設(shè)計(jì)引物對(duì)連接后片段進(jìn)行擴(kuò)增，最后通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增后的DNA片段[31-32]。2011年，Tourasse等[33]通過(guò)結(jié)合2 214 株分離菌株的AFLP與多位點(diǎn)序列分型、多位點(diǎn)酶電泳分型數(shù)據(jù)對(duì)B. cereus群進(jìn)行分析；結(jié)果表明B. cereus群中可以發(fā)現(xiàn)來(lái)源不同且親緣關(guān)系非常近的新群，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了來(lái)自食品的B. cereus分離菌株可以與臨床、環(huán)境等其他來(lái)源的B. cereus分離菌株基因型相同，這是之前所不被認(rèn)可的。AFLP具有多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但AFLP技術(shù)所用引物取決于接頭，對(duì)接頭技術(shù)要求較高，所以目前運(yùn)用AFLP對(duì)B. cereus分型的研究并不多見(jiàn)[34]。

2.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）技 術(shù)是1984年Schwartz等[35]發(fā)明的一種電泳技術(shù)，用于分離大片段線性DNA分子。這種方法的原理是DNA分子在交替變換的脈沖電場(chǎng)下泳動(dòng)方向發(fā)生改變，且不同分子質(zhì)量的DNA分子定向速率不同，分子質(zhì)量小的DNA分子比大的DNA分子重新定向快、在凝膠中移動(dòng)速率快，最終可以分離大小不同的DNA片段，達(dá)到分型的目的[36]。2011年，Kim等[37]運(yùn)用PFGE對(duì)39 株產(chǎn)嘔吐毒素B. cereus（35 株臨床分離菌株和4 株食品分離菌株）及3 株產(chǎn)腸毒素B. cereus參考菌株進(jìn)行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在70%的相似性水平下分為17 個(gè)型，且臨床分離菌株的電泳條帶多于食品分離菌株；通過(guò)結(jié)合生物學(xué)特性、PFGE型、RAPD型及抗生素耐藥型數(shù)據(jù)，這些菌株被分為7 個(gè)型，其中7型由3 株產(chǎn)腸毒素B. cereus參考菌株組成，5型和6型涵蓋了大部分的產(chǎn)嘔吐毒素B. cereus，且5型均為臨床分離株，說(shuō)明PFGE分型與其他分型方法結(jié)合可以把產(chǎn)腸毒素B. cereus與產(chǎn)嘔吐毒素B. cereus區(qū)分開(kāi)，同時(shí)也可以用于區(qū)分部分臨床分離菌株和食品分離菌株。PFGE技術(shù)具有分辨率強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病原菌的溯源、臨床及醫(yī)學(xué)等方面，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、易受主觀因素的影響，目前在B. cereus分型中的應(yīng)用并不廣泛。

2.6 全基因組測(cè)序分型

全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）技術(shù)是基于細(xì)菌的整個(gè)基因組對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型的方法，該方法對(duì)流行病學(xué)的調(diào)查至關(guān)重要，并且將來(lái)可能會(huì)應(yīng)用于臨床[38-39]。近年來(lái)，隨著一些技術(shù)手段的發(fā)展，WGS技術(shù)正趨向于低成本、高通量。然而WGS技術(shù)最大的挑戰(zhàn)不在于測(cè)序的成本及實(shí)施的復(fù)雜性，而在于大量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生[9,40]。運(yùn)用WGS技術(shù)對(duì)微生物分型的重要條件是有一個(gè)可利用的網(wǎng)絡(luò)生物信息和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存平臺(tái)，且該平臺(tái)儲(chǔ)存的WGS參考數(shù)據(jù)庫(kù)能逐漸增多。目前鮮見(jiàn)運(yùn)用WGS技術(shù)對(duì)B. cereus進(jìn)行分型的報(bào)道，但隨著B(niǎo). cereus研究的不斷深入以及WGS技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用WGS技術(shù)對(duì)B. cereus進(jìn)行研究將有很廣闊的空間[41]。

2.7 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分型

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ion ization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)作為新興的技術(shù)，其應(yīng)用于菌種鑒定和分型中的研究越來(lái)越多。這種方法主要是通過(guò)檢測(cè)微生物的核糖體蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與已知微生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)進(jìn)行菌種鑒定，并基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)聚類而進(jìn)行分型[42]。MALDI-TOF-MS鑒定速率快，100 個(gè)樣品從點(diǎn)樣到分析出結(jié)果，大約需要1 h，同時(shí)該方法還具有操作簡(jiǎn)單、高通量、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但該方法也存在儀器比較昂貴、成本高、對(duì)微生物的純度要求高等缺點(diǎn)[43]。目前，運(yùn)用MALDI-TOF-MS方法對(duì)B. cereus進(jìn)行鑒定和分型的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，但該技術(shù)應(yīng)用于其他細(xì)菌的報(bào)道已經(jīng)很 多，Espinal等[44]運(yùn)用MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)不動(dòng)桿菌屬分離株的不同種進(jìn)行了區(qū)分，為其他細(xì)菌的分型提供了參考；趙貴明等[45]運(yùn)用MALDI-TOF-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)克羅諾桿菌的鑒定和分型，并且其分型結(jié)果與分子分型結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明了該方法的準(zhǔn)確性和發(fā)展空間。盡管目前MALDI-TOF-MS技術(shù)存在一些局限，但該方法高效率、高通量等優(yōu)點(diǎn)決定其必將成為B. cereus分型技術(shù)發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。

3 結(jié) 語(yǔ)

本文對(duì)B. cereus的噬菌體分型、生化分型等傳統(tǒng)分型方法以及MLST、Rep-PCR、RAPD、PFGE等分子分型方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。MLST技術(shù)應(yīng)用范圍較廣，幾乎適用于所有種屬的細(xì)菌，目前MLST多用于B. cereus群內(nèi)B. anthracis、B. cereus、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）等各個(gè)種的區(qū)分，也常用于產(chǎn)嘔吐毒素B. cereus的識(shí)別，研究發(fā)現(xiàn)序列型ST26是產(chǎn)嘔吐毒素B. cereu s的優(yōu)勢(shì)菌株[18]。MLST可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)在全球范圍內(nèi)共享，提高了核酸序列變異分析的可靠性和自動(dòng)化，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成本的下降，MLST將會(huì)在B. cereus鑒定、分型發(fā)揮更大的作用[46]。REP-PCR分型是一種有效的基因分型方法，在微生物鑒定、分型及親緣關(guān)系研究中有廣闊的前景，比較適用于B. cereus分型。但REP-PCR的分型效果易受反應(yīng)體系、循環(huán)參數(shù)等外界因素的影響，所以需要 建立一種高效、穩(wěn)定的REP-PCR分型體系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)B. cereus的高效、準(zhǔn)確的分型[47]。RAPD技術(shù)在微生物的分類鑒定、溯源等方面應(yīng)用廣泛，目前多用于芽孢桿菌的多樣性研究。Oguntoyinbo等[48]結(jié)合RAPD和核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)芽孢桿菌屬內(nèi)B. cereus、B. subtilis、B. licheniformis等的區(qū)分。AFLP和PFGE技術(shù)雖有諸多優(yōu)勢(shì)，但目前在B. cereus分型中的應(yīng)用并不普遍，常與其他分型方法結(jié)合對(duì)B. cereus進(jìn)行分型。

隨著科技的發(fā)展，越來(lái)越多的細(xì)菌分型方法應(yīng)運(yùn)而生，逐漸向高效率、低成本、高分辨率、高通量的方向發(fā)展。選擇合理的B. cereus分型方法有利于該菌的溯源，從而預(yù)防和控制該菌引起的食源性疾病。

[1] 衛(wèi)生部. 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn): GB 4789.14—2014[S].北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2014: 1-4.

[2] 蔣原. 食源性病原微生物檢測(cè)指南[M]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010: 304-317.

[3] 王慧瑩. 基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)技術(shù)快速檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2011: 1-4.

[4] ZHANG Z, FE NG L, XU H, et al. Detection of viable enterotoxinproducing Bacillus cereus and analysis of toxigenicity from readyto-eat foods and infant formula milk powder by multiplex PCR[J]. Journal of Dairy Science, 2016, 99(2): 1047-1055. DOI:10.3168/ jds.2015-10147.

[5] BERTHOLD-PLUTA A, PLUTA A, GARBOWSKA M. The effect of selected factors on the survival of Bacillus cereus in the human gastrointestinal tract[J]. Mic robial Pathogenesis, 2015, 82: 7-14. DOI:10.1016/j.micpath.2015.03.015.

[6] RATHER M A, AULAKH R S, G ILL J P S, et al. Detection and sequencing of plasmid encoded tetracycline resistance determinan ts (tetA and tetB) from food-borne Bacillus cereus isolates[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 2012, 5(9): 709-712. DOI:10.1016/S1995-7645(12)60111-4.

[7] DIERICK K, VAN COILLIE E, SWIECICKA I, et al. Fatal family outbreak of Bacillus cereus-associated food poisoning[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43(8): 4277-4279. DOI:10.1128/ JCM.43.8.4277-4279.2005.

[8] CHON J W, KIM J H, LEE S J, et al. Toxin profile, antibiotic resistance, and phenotypic and molecular characterization of Bacillus cereus in Sunsik[J]. Food Microbiology, 2012, 32(1): 217-222. DOI:10.1016/j.fm.2012.06.003.

[9] MACCANNELL D. Bacterial strain typing[J]. Clinics in Laboratory Medicine, 2013, 33(3): 629-650. DOI:10.1016/j.cll.2013.03.005.

[10] VAN BELKUM A, TASSIOS P T, DIJKSHOORN L, et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology[J]. Clinical Microbiology and Infection, 2007, 13: 1-46. DOI:10.1111/j.1469-0691.2007.01786.x.

[11] 姚敬業(yè), 徐鳳霓, 周家華, 等. 我國(guó)若干地區(qū)蠟樣芽孢桿菌723 株噬菌體分型的初步報(bào)告[J]. 微生物學(xué)雜志, 1988, 8(1): 1-5.

[12] 李春, 撒楠, 胡萬(wàn)富, 等. 食品中蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定與分型[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2015, 25(14): 2313-2314; 2318.

[13] PéREZ-LOSADA M, CABEZAS P, CASTRO-NALLAR E, et al. Pathogen typing in the genomics era: MLST and the future of molecular epidemiology[J]. Infection, Genetics and Evolution, 2013, 16: 38-53. DOI:10.1016/j.meegid.2013.01.009.

[14] TAYLOR J W, GEISER D M, BURT A, et al. The evolutionary biology and population genetics underlying fungal strain typing[J]. Clinical Microbiology Reviews, 1999, 12(1): 126-146.

[15] 徐海燕, 張和平. 多位點(diǎn)序列分型技術(shù)以及在乳酸菌分類鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2013, 41(8): 36-39.

[16] 田雪, 王娉, 陳穎, 等. 克羅諾桿菌(阪崎腸桿菌)分子分型技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 衛(wèi)生研究, 2014, 43(5): 862-866; 872.

[17] OLSEN J S, SKOGAN G, FYKSE E M, et al. Genetic distribution of 295 Bacillus cereus group members based on adk-screening in combination with MLST (Multilocus Sequence Typing) used for validating a primer targeting a chromosomal locus in B. anthracis[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 71(3): 265-274. DOI:10.1016/j.mimet.2007.10.001.

[18] 劉勇. 對(duì)大米中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的多位點(diǎn)序列分型和毒力評(píng)價(jià)研究[D]. 武漢: 武漢輕工大學(xué), 2014: 15-38.

[19] VERSALOVIC J, KOEUTH T, LUPSKI R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fi nerpriting of bacterial enomes[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(24): 6823-6831. DOI:10.1093/nar/19.24.6823.

[20] MALUPING R P, RAVELO C, LAVILLA-PITOGO C R, et al. Molecular typing of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from the Philippines by PCR-based methods[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 99(2): 383-391. DOI:10.1111/j.1365-2672.2005.02571.x.

[21] MISHRA R K, PANDEY B K, PATHAK N, et al. BOX-PCR-and ERIC-PCR-based genotyping and phylogenetic correlation among Fusarium oxysporum isolates associated with wilt disease in Psidium guajava L.[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2015, 4(1): 25-32. DOI:10.1016/j.bcab.2014.09.012.

[22] RAMPADARATH S, PUCHOOA D, BAL S. Repetitive element palindromic PCR (REP-PCR) as a genetic tool to study interspecific diversity in Euphorbiaceae family[J]. Electronic Jour nal of Biotechnology, 2015, 18(6): 412-417. DOI:10.1016/ j.ejbt.2015.09.003.

[23] LóPEZ A C, ALIPPI A M. Phenotypic and genotypic diversity of Bacillus cereus isolates recovered from honey[J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 117(2): 175-184. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2007.03.007.

[24] CHAVES J Q, PIRES E S, VIVONI A M. Genetic diversity, antimicrobial resistance and toxigenic profiles of Bacillus cereus isolated from food in Brazil over three decades[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 147(1): 12-16. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2011.02.029.

[25] MANZANO M, GIUSTO C, IACUMIN L, et al. Molecular methods to evaluate biodiversity in Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains from different origins[J]. Food Microbiology, 2009, 26(3): 259-264. DOI:10.1016/j.fm.2008.12.012.

[26] HADRYS H, BALICK M, SCHIERWATER B. Applications of random amplifi ed polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology[J]. Molecular Ecology, 1992, 1(1): 55-63. DOI:10.1111/j.1365-294X.1992.tb00155.x.

[27] THORSEN L, AZOKPOTA P, HANSEN M B, et al. Identification, genetic diversity and cereulide producing ability of Bacillus cereus group strains isolated from Beninese traditional fermented food condiments[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 142(1): 247-250. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.06.004.

[28] OH M H, HAM J S, COX J M. Diversity and toxigenicity among members of the Bacillus cereus group[J]. International Journal of Food Microbiology, 2012, 152(1/2): 1-8. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2011.09.018.

[29] HALL A, GRIFFITHS H, SALTMARSH M, et al. Profi ling Bacillus cereus populations in a traditional style, hot-drinks vending machine and vended hot chocolate drink using polymerase chain reaction (PCR) and random amplifi ed polymorphic DNA (RAPD) techniques[J]. Food Control, 2012, 27(1): 127-131. DOI:10.1016/j.foodcont.2012.02.028.

[30] 劉毅, 姚粟, 李輝, 等. 三種DNA指紋圖譜技術(shù)在菌株分型中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31(6): 81-86. DOI:10.13560/j.cnki.biotech. bull.1985.2015.06.012.

[31] VOS P, HOGERS R, BLEEKER M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23(21): 4407-4414. DOI:10.1093/nar/23.21.4407.

[32] 趙一鳴. 三種分型技術(shù)對(duì)食源性單增李斯特菌分型研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué), 2015: 17-22.

[33] TOURASSE N J, HELGASON E, KLEVAN A, et al. Extended and global phylogenetic view of the Bacillus cereus group population by combination of MLST, AFLP, and MLEE genotyping data[J]. Food Microbiology, 2011, 28(2): 236-244. DOI:10.1016/j.fm.2010.06.014.

[34] 郭玉梅, 周吉坤, 張慧賢, 等. 嗜肺軍團(tuán)菌SBT, PFGE, AFLP分子分型方法的比較[J]. 微生物學(xué)雜志, 2014, 34(1): 72-77. DOI:10.3969/ j.issn.1005-7021.014.01.014.

[35] SCHWARTZ D C, CANTOR C R. Separation of yeast chromosomesized DNAs by pulsed fi eld gradient gel electrophoresis[J]. Cell, 1984, 37(1): 67-75. DOI:10.1016/0092-8674(84)90301-5.

[36] 葉蕊, 石麗媛, 王鵬, 等. 脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)簡(jiǎn)介及其在細(xì)菌分子分型中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志, 2013, 24(2): 182-185.

[37] KIM J B, PARK J S, KIM M S, et al. Genetic diversity of emetic toxin producing Bacillus cereus Korean strains[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 150(1): 66-72. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2011.07.014.

[38] ZAKOUR L B N, VENTURINI C, BEATSON S A, et al. Analysis of a Streptococcus pyogenes puerperal sepsis cluster by use of wholegenome sequencing[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2012, 50(7): 2224-2228. DOI:10.1128/JCM.00675-12.

[39] GRAD Y H, LIPSITCH M, FELDGARDEN M, et al. Genomic epidemiology of the Escherichia coli O104: H4 outbreaks in Europe, 2011[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(8): 3065-3070. DOI:10.1073/pnas.1203264109.

[40] GHERARDI G, CRETI R, POMPILIO A, et al. An overview of various typing methods for clinical epidemiology of the emerging pathogen Stenotrophomonas maltophilia[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2015, 81(3): 219-226. DOI:10.1016/ j.diagmicrobio.2014.11.005.

[41] FRANZ E, DELAQUIS P, MORABITO S, et al. Exploiting the explosion of information associated with whole genome sequencing to tackle Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) in global food production systems[J]. International Journal of Food Microbiology, 2014, 187: 57-72. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.07.002.

[42] NOMURA F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): a revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2015, 1854(6): 528-537. DOI:10.1016/ j.bbapap.2014.10.022.

[43] WIESER A, SCHNEIDER L, JUNG J, et al. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(3): 965-974. DOI:10.1007/s00253-011-3783-4.

[44] ESPINAL P, SEIFERT H, DIJKSHOORN L, et al. Rapid and accurate identification of genomic species from the Acinetobacter baumannii (Ab) group by MALDI-TOF MS[J]. Clinical Microbiology and Infection, 2012, 18(11): 1097-1103. DOI:10.1111/j.1469-0691. 2011.03696.x.

[45] 趙貴明, 劉洋, 陳穎, 等. 克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(8): 105-110. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201408020.

[46] MAIDEN M C. Multilocus sequence typing of bacteria[J]. Annual Review of Microbiology, 2006, 60: 561-588. DOI:10.1146/annurev. micro. 59.030804.121325.

[47] 鄭揚(yáng)云, 吳清平, 吳克剛, 等. 空腸彎曲菌分離株ERIC-PCR分型和生化分型的比較研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2013, 29(8): 1843-1850. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2013.08.033.

[48] OGUNTOYINBO F A, HUCH M, CHO G S, et al. Diversity of Bacillus species isolated from Okpehe, a traditional fermented soup condiment from Nigeria[J]. Journal of Food Protection, 2010, 73(5): 870-878. DOI:10.4315/0362-028X-73.5.870.

Advances in Methods for Bacillus cereus Typing

CAO Feiyang1,2, WANG Ping1, JIANG Lianzhou2, CHEN Ying1,*
(1. Agro-Product Safety Research Center, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China; 2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Bacillus cereus is a food-borne opportunistic pathogen widely present in the environment and foods. It is frequently associated with two types of food-borne illness: emesis and diarrhea. The study on Bacillus cereus typing has important implications for the prevention, early warning, tracing and molecular epidemi ological survey of Bacillus cereus. Currently, the popular methods for typing Bacillus cereus include traditional typing methods such as phage typing and biochemical typing, and molecular typing methods such as multilocus sequence typing, repetitive sequence-PCR, random amplifi ed polymorphic DNA, and pulsed-fi eld gel electrophoresis. In this paper, all these methods are reviewed with the aim of providing references for the typing of Baci llus cereus.

Bacillus cereus; traditiona l typing methods; molecular typing methods

10.7506/spkx1002-6630-201717046

TS207.4

A

1002-6630（2017）17-0286-05引文格式：

2016-07-28

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFD0401102）；中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院院所基金項(xiàng)目（2016JK006）作者簡(jiǎn)介：曹飛揚(yáng)（1989—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測(cè)與控制。E-mail：feiyangc@163.com

*通信作者：陳穎（1972—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全與控制。E-mail：chenyingcaiq@163.com