響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸脅迫藜麥富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件及體外降血壓活性研究

郭曉蒙，趙富士，冶曉惠，馬挺軍,2,*

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.農(nóng)業(yè)生物制品與種業(yè)中關(guān)村開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸脅迫藜麥富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件及體外降血壓活性研究

郭曉蒙1，趙富士1，冶曉惠1，馬挺軍1,2,*

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.農(nóng)業(yè)生物制品與種業(yè)中關(guān)村開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

為優(yōu)化檸檬酸脅迫藜麥富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的最優(yōu)培養(yǎng)條件，采用超聲波提取，高效液相色譜法檢測(cè)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸溶液濃度、培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)芽藜麥中GABA含量的影響。結(jié)果表明：發(fā)芽藜麥在檸檬酸脅迫下富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為檸檬酸溶液濃度2.00 mmol/L、培養(yǎng)溫度25 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h，在此培養(yǎng)條件下發(fā)芽藜麥中GABA含量為1.538 mg/g，是藜麥種子中GABA含量的3.8 倍。體外降血壓實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：檸檬酸脅迫藜麥發(fā)芽后血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率為63%，分別是用去離子水發(fā)芽的藜麥和藜麥種子的1.3 倍和1.9 倍，即檸檬酸脅迫藜麥發(fā)芽后可以提高其降血壓活性。研究結(jié)果為藜麥的進(jìn)一步研究提供了一定的理論依據(jù)。

藜麥；發(fā)芽；檸檬酸脅迫；γ-氨基丁酸；響應(yīng)面優(yōu)化

藜麥（Chenopodium quinoa），又名昆諾阿藜、南美藜等，是一年生的藜科草本植物。原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是印加土著居民的傳統(tǒng)食物，距今有7 000多年的種植歷史，原產(chǎn)地多為海拔3 000～4 800 m的高原地區(qū)，具有抗寒抗旱等特性[1-2]。藜麥蛋白質(zhì)中賴氨酸含量高達(dá)5.1%～6.4%[3]；脂肪含量為50～72 mg/g，其中甘油三酯占50%以上[4]；藜麥還富含Mn、Fe、Mg、Ca等礦物質(zhì)，其含量比大宗作物中礦物質(zhì)含量高[5]；藜麥中含有VB1、VB2、VC等維生素，每100 g藜麥中VB1和VB2的含量均能滿足兒童每日所需量的80%左右[6]。同時(shí)，藜麥富含多種生物活性物質(zhì)，如黃酮、酚酸、皂苷等，其中黃酮含量一般在36.2～144.3 mg/100 g，并且Hirose等[7]利用高效液相色譜法分析了4 種藜麥中的黃酮，并對(duì)不同的品種間黃酮含量差異性進(jìn)行了比較。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)為，藜麥?zhǔn)俏ㄒ坏膯误w植物即可滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物，正式推薦藜麥為最適宜人類食用的完美營(yíng)養(yǎng)食品，并列入全球十大營(yíng)養(yǎng)品之一[8]。藜麥種子不含膽固醇，低脂、低熱量、低糖，含有多種氨基酸和礦物質(zhì)，其中包括人體必需的8 種氨基酸，比例均衡且易于吸收，是糖尿病患者、素食主義者以及孕嬰理想安全的食品[9-11]。

4-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種以自由態(tài)廣泛存在于原核生物和真核生物中的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸[12-13]。因GABA具有降血壓、改善腦機(jī)能和緩解疼痛和焦慮等作用，富含GABA的食品，近年來備受消費(fèi)者喜愛[14-16]。研究表明，植物中GABA的合成主要受GABA支路和多胺降解的影響，其中谷氨酸脫羧酶（glutamatede carboxylase，GAD）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）分別是這兩條途徑中的限速酶[17]。植物在受熱、受冷、鹽脅迫、酸脅迫、低氧脅迫等條件下刺激會(huì)強(qiáng)烈激活GAD和DAO酶活性，從而促使GABA富集[18]。已有部分學(xué)者對(duì)CO2處理[19]、低氧脅迫[20]、金屬離子脅迫[21]等進(jìn)行研究，但利用酸溶液脅迫發(fā)芽目前很少見到相關(guān)研究。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種與金屬鋅螯合的二肽羧基肽酶，在體內(nèi)血壓調(diào)節(jié)過程中起到重要作用[22]，哺乳動(dòng)物血壓的主要生物調(diào)節(jié)是通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS），血管緊張素Ⅱ與其在動(dòng)脈系統(tǒng)的平滑肌細(xì)胞上的受體結(jié)合，引起血管收縮和血壓升高。ACE屬于限制酶，可以抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，從而抑制血壓升高[23]，并且同時(shí)ACE能催化具有降壓作用的舒緩激肽降解[24]，所以ACE抑制率可以作為降血壓實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)指標(biāo)[25]。

本研究為優(yōu)化檸檬酸脅迫藜麥富集GABA的最優(yōu)培養(yǎng)條件，以藜麥種子為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸溶液濃度、培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)芽藜麥中GABA含量的影響，并對(duì)優(yōu)化的藜麥芽抑制ACE活性進(jìn)行分析，并為藜麥的進(jìn)一步研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥由河北張家口農(nóng)科院提供，置于-18 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

GABA標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、ACE 美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 韓國(guó)Duksan公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；KQ-700E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TDZ5M型臺(tái)式低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙易達(dá)儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀（配有1200可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和ChemStation色譜工作站） 美國(guó)Agilent公司；BSA224S型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DH-101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥種子發(fā)芽處理

稱取一定質(zhì)量的藜麥種子用去離子水清洗后，用1%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，用去離子水清洗干凈（pH 7），然后去離子水浸泡2 h，均勻放入鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置約50 粒藜麥種子，然后放入生化培養(yǎng)箱中暗發(fā)芽，發(fā)芽相對(duì)濕度為80%～95%左右，期間每12 h噴檸檬酸溶液（實(shí)驗(yàn)濃度）或去離子水（對(duì)照）2.0 mL。培養(yǎng)結(jié)束后，用去離子水清洗發(fā)芽藜麥，在50 ℃條件下干燥，然后粉碎，過80 目篩，待測(cè)。

1.3.2 藜麥芽中GABA含量的測(cè)定

柱前衍生化處理：根據(jù)張志清等[26]方法改進(jìn)，準(zhǔn)確稱取0.5 g藜麥芽粉，以1∶20（g/mL）的料液比將70%的甲醇溶液和藜麥芽粉混合均勻，置于具塞試管中，在50 ℃、700 W條件下提取20 min，然后將混合液移至50 mL離心管中，4 000 r/min離心15 min，取上清液10 μL于樣品瓶中，添加50 μL的鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）衍生液充分振蕩，靜置5 min，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，待測(cè)。

色譜條件：根據(jù)鄭鴻雁等[27]方法優(yōu)化改進(jìn)，采用OPA柱前衍生紫外檢測(cè)高效液相色譜法測(cè)定藜麥芽中GABA含量。色譜柱：TC-C18（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.02 mmol/L乙酸鈉溶液，流動(dòng)相B為純乙腈；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序如表1所示。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用OPA衍生后進(jìn)行色譜分析，根據(jù)色譜圖中峰面積計(jì)算GABA含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值，以色譜圖中峰面積為縱坐標(biāo)，以待測(cè)樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=2.7624x（R2=0.999 1），數(shù)據(jù)顯示曲線擬合性良好。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 檸檬酸溶液濃度的選擇

稱取10.0 g藜麥種子，檸檬酸溶液濃度分別為0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mmol/L，控制培養(yǎng)溫度為25 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，然后按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定不同檸檬酸溶液濃度對(duì)藜麥發(fā)芽富集GABA的影響。以藜麥芽中GABA的含量為測(cè)定指標(biāo)，以去離子水發(fā)芽的藜麥為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.3.4.2 培養(yǎng)溫度的選擇

稱取10.0 g藜麥種子，培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、 35 ℃，控制檸檬酸溶液濃度為2.00 mmol/L，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，然后按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定不同培養(yǎng)溫度對(duì)藜麥發(fā)芽富集GABA的影響。以藜麥芽中GABA的含量為測(cè)定指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.3.4.3 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

稱取10.0 g藜麥種子，培養(yǎng)時(shí)間為24、48、72、96、 120 h，控制檸檬酸溶液濃度為2.00 mmol/L，培養(yǎng)溫度為25 ℃，然后按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定不同培養(yǎng)溫度對(duì)藜麥發(fā)芽富集GABA的影響。以藜麥芽中GABA的含量為測(cè)定指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.3.5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 8.0.6軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合優(yōu)化藜麥芽中GABA含量的工藝條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇檸檬酸溶液濃度（A）、培養(yǎng)溫度（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）作為響應(yīng)面優(yōu)化的試驗(yàn)點(diǎn)，自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，共設(shè)計(jì)17 組試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 組為析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；5組為區(qū)域的中心零點(diǎn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)因素和水平見表2。

1.3.6 檸檬酸脅迫藜麥芽的體外抑制ACE活性分析

根據(jù)Cushman等[28]的方法略作修改，準(zhǔn)確稱取0.5 g藜麥芽粉，以1∶20（g/mL）的料液比將70%甲醇溶液和藜麥芽粉混合均勻，然后置于具塞試管中在50 ℃、700 W的條件下提取20 min，然后將混合液移至50 mL離心管中，4 000 r/min離心15 min，準(zhǔn)確移取100 μL上清液與100 μL 5 mmol/L HHL溶液混合均勻，立即37 ℃水浴，保溫5min，然后加入0.1 U/mL ACE溶液10 μL，于37 ℃恒溫水浴中充分反應(yīng)30 min，加入150 μL，1 mol/L HCl溶液用于終止反應(yīng)，再加入1.5 mL乙酸乙酯充分振蕩混合均勻，在4 000 r/min離心5 min后吸取1 mL酯層于另一支試管中，80 ℃烘干冷卻后重新溶于3 mL超純水中，于228 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。以未發(fā)芽藜麥和去離子水發(fā)芽藜麥作對(duì)照。ACE抑制率按以下公式計(jì)算。

式中：A為ACE和ACE抑制劑同時(shí)存在時(shí)的吸光度；B為不加ACE抑制劑時(shí)的吸光度（用去離子水代替ACE抑制劑）；C為ACE與ACE抑制劑均不參加反應(yīng)時(shí)的吸光度（用去離子水代替ACE抑制劑，并在反應(yīng)前加HCl終止反應(yīng)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 檸檬酸溶液濃度對(duì)藜麥芽中GABA含量的影響

如圖1所示，不同濃度的檸檬酸溶液對(duì)藜麥芽中GABA含量的影響有顯著性差異（P＜0.05）。檸檬酸溶液濃度在0.00～2.00 mmol/L范圍內(nèi)，GABA含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，其中2.00 mmol/L時(shí)GABA含量最高，此時(shí)GABA含量為0.500 mg/g，是對(duì)照組（0.377 mg/g）的1.31 倍。當(dāng)檸檬酸溶液濃度高于2.00 mmol/L時(shí)，GABA含量逐漸下降，原因可能是檸檬酸溶液濃度過高會(huì)使藜麥發(fā)芽過程中pH值偏低，藜麥中的GAD和DAO酶活性降低，從而抑制GABA的富集[29]。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)藜麥芽中GABA含量的影響

由圖2可知，培養(yǎng)溫度在15～25 ℃范圍內(nèi)，GABA含量呈迅速的上升趨勢(shì)，在25～35 ℃范圍內(nèi)GABA含量逐漸下降，其中25 ℃條件下培養(yǎng)的藜麥芽中GABA含量最高，達(dá)到0.774 mg/g，與20 ℃（0.503 mg/g）和30 ℃（0.382 mg/g）條件下培養(yǎng)的藜麥芽中的GABA具有顯著性差異（P＜0.05），表明藜麥在25 ℃時(shí)發(fā)芽富集GABA效果比較好。

2.1.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)藜麥芽中GABA含量的影響

如圖3所示，不同的發(fā)芽培養(yǎng)時(shí)間對(duì)藜麥中GABA含量具有顯著性差異（P＜0.05）。藜麥種子中GABA含量為0.402 mg/g，發(fā)芽24 h后藜麥中GABA含量迅速上升，達(dá)到1.060 mg/g。發(fā)芽48 h后，GABA含量繼續(xù)上升，達(dá)到1.127 mg/g，此時(shí)藜麥芽中GABA含量是藜麥種子中GABA含量的2.8 倍。發(fā)芽48～120 h，GABA含量呈下降趨勢(shì)，其原因可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，GABA轉(zhuǎn)換成琥珀酸半醛，從而使得GABA含量下降[30]。綜上分析可知：藜麥在第48小時(shí)發(fā)芽富集GABA效果較好。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6軟件包，以檸檬酸溶液濃度（A）、培養(yǎng)溫度（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）為自變量，以藜麥芽中GABA含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件包對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立GABA含量（Y）的二階響應(yīng)回歸模型，進(jìn)而分析各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值Y的影響。擬合二次多項(xiàng)式方程如下：

對(duì)該回歸模型及系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，其結(jié)果見表4。從整體上，該模型P＜0.001，模型差異極顯著。失擬項(xiàng)P=0.378 1＞0.05，沒有顯著性差異，說明該模型對(duì)本試驗(yàn)擬合程度良好。模型一次項(xiàng)A、C均對(duì)響應(yīng)值GABA含量影響顯著（P＜0.05）；AB、AC交互作用極顯著（P＜0.01），BC交互作用不顯著；一次項(xiàng)B，二次項(xiàng)A2、B2、C2均對(duì)響應(yīng)值GABA含量影響極顯著（P＜0.01）。3 個(gè)因素對(duì)GABA含量的影響依次為B＞C＞A，即培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時(shí)間＞檸檬酸溶液濃度。結(jié)果表明：3 個(gè)因素對(duì)藜麥芽中GABA含量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。剔除不顯著項(xiàng)，將擬合方程修正為：

Y=0.210-0.025A-0.011B+0.037C-2.250× 10-3AB-2.750×10-3AC-0.024A2-0.084B2-0.027C2

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值和影響因子A、B、C之間的關(guān)系構(gòu)成的三維空間立體結(jié)構(gòu)圖，根據(jù)線性回歸模型繪制相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，直觀分析3 個(gè)因素對(duì)藜麥芽中GABA含量的交互作用，響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于試驗(yàn)條件的改變?cè)矫舾?，該因素?duì)藜麥芽中GABA含量的測(cè)定影響越大；對(duì)于等高線則可以直觀反映兩變量的交互作用顯著程度，橢圓形表示兩因素之間作用顯著，而圓形則表示不顯著[31]，結(jié)果見圖4。

由圖4a可知，響應(yīng)面的坡度較陡峭，表示在培養(yǎng)時(shí)間為48 h條件下，檸檬酸溶液濃度和培養(yǎng)溫度交互作用顯著，在培養(yǎng)溫度較低時(shí)，GABA含量隨著檸檬酸溶液濃度的增加而增大，隨著培養(yǎng)溫度的升高，增加幅度減小甚至下降，說明在不同培養(yǎng)溫度下，檸檬酸溶液濃度對(duì)GABA含量的影響也不同；圖4b顯示在培養(yǎng)溫度為25 ℃條件下，培養(yǎng)時(shí)間和檸檬酸溶液濃度交互作用顯著，在培養(yǎng)時(shí)間較短時(shí)，GABA含量隨著檸檬酸溶液濃度的增加而增加，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，增加幅度逐漸減低；圖4c顯示在檸檬酸溶液濃度為2.00 mmol/L的條件下，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用不顯著，說明培養(yǎng)時(shí)間對(duì)GABA含量產(chǎn)生的影響與培養(yǎng)溫度無關(guān)。

利用Design-Expert 8.0.6軟件，結(jié)合回歸模型和響應(yīng)面圖分析得出藜麥發(fā)芽的最佳培養(yǎng)條件為：檸檬酸溶液濃度2.00 mmol/L、培養(yǎng)溫度24.68 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48.24 h。在此條件下，預(yù)測(cè)藜麥中GABA最高含量為1.542 mg/g。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整為：檸檬酸溶液濃度2.00 mmol/L、培養(yǎng)溫度25 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h，在此條件下重復(fù)試驗(yàn)3 次，測(cè)得GABA含量的平均值為1.538 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值基本吻合，說明此模型可靠。最終優(yōu)化的藜麥發(fā)芽培養(yǎng)條件確定為檸檬酸溶液濃度2.00 mmol/L，培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h。

2.3 體外抑制ACE活性測(cè)定結(jié)果

如圖5所示，2.00 mmol/L的檸檬酸脅迫發(fā)芽的藜麥（實(shí)驗(yàn)組）和去離子水發(fā)芽的藜麥（對(duì)照組1）置于生化培養(yǎng)箱中，在25 ℃條件下培養(yǎng)48 h，然后50 ℃烘干，粉碎，過80 目篩。準(zhǔn)確稱取0.5 g的試驗(yàn)組、對(duì)照組1、對(duì)照組2（藜麥種子）粉末，按照方法1.3.6節(jié)，對(duì)其體外抑制ACE酶活性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1和對(duì)照組2三者的ACE抑制率均有顯著性差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組ACE抑制率（63%）分別是對(duì)照組1（49%）和對(duì)照組2（33%）的1.3 倍和1.9 倍，以上數(shù)據(jù)表明利用檸檬酸脅迫藜麥發(fā)芽，可以促進(jìn)藜麥中GABA含量增加，從而提高其降血壓活性。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法，以GABA含量為響應(yīng)值，對(duì)藜麥的發(fā)芽培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳培養(yǎng)條件為檸檬酸溶液濃度2.00 mmol/L、培養(yǎng)溫度25 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h，在此條件下GABA含量達(dá)到1.538 mg/g，是藜麥種子中GABA含量（0.402 mg/g）的3.8 倍。體外降血壓實(shí)驗(yàn)表明：2.00 mmol/L的檸檬酸脅迫藜麥芽干質(zhì)量的ACE抑制率為63%，分別是去離子水脅迫藜麥芽干質(zhì)量和藜麥種子干質(zhì)量的1.3 倍和1.9 倍，充分說明檸檬酸脅迫發(fā)芽可以提高藜麥的降血壓活性。以上研究為開發(fā)藜麥產(chǎn)品提供一定理論依據(jù)。

[1] JACOBSEN S E. The worldwide potential for quinoa (Chenopodium quinoa Willd.)[J]. Food Reviews International, 2003, 19: 176. DOI:10.1081/FRI-120018883.

[2] 顧嫻, 黃杰, 魏玉明, 等. 藜麥研究進(jìn)展及發(fā)展前景[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2015, 31(30): 201-204. DOI:10.14083/j.issn.1001-4942.2016.10.033.

[3] NOWAK V, DU J, CHARRONDIèRE U R. Assessment of the nutritional composition of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.)[J]. Food Chemistry, 2016, 193: 47-54. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.02.111.

[4] NAVRUZ-VARLI S, SANLIER N. Nutritional and health benefits of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.)[J]. Journal of Cereal Science, 2016, 69: 371-376. DOI:10.1016/j.jcs.2016.05.004.

[5] VIDUERIOS S M, CURTI R N, DYNER L M, et al. Diversity and interrelationships in nutritional traits in cultivated quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) from Northwest Argentina[J]. Journal of Cereal Science, 2015, 62: 87-93. DOI:10.1016/j.jcs.2015.01.001.

[6] RUALES J, NAIR B M. Content of fat, vitamins and minerals in quinoa (Chenopodium quinoa Willd) seeds[J]. Food Chemistry, 1993, 48(2): 131-136. DOI:10.1016/0308-8146(93)90047-J.

[7] HIROSE Y, FUJITA T, ISHII T, et al. Antioxidative properties and flavonoid composition of Chenopodium quinoa seeds cultivated in Japan[J]. Food Chemistry, 2010, 119(4): 1300-1306. DOI:10.1016/ j.foodchem.2009.09.008.

[8] 闕淼琳, 蔣玉蓉, 曹美麗, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化藜麥種子多酚提取工藝及其品種差異[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 7-12. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604002.

[9] 肖正春, 張廣倫. 藜麥及其資源開發(fā)利用[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2014, 33(2): 62-66. DOI:10.3969/j.issn.1006-9690.2014.02.015.

[10] 王晨靜, 趙習(xí)武, 陸國(guó)權(quán), 等. 藜麥特性及開發(fā)利用研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 31(2): 296-301. DOI:10.11833/ j.issn.2095-0756.2014.02.020.

[11] VEGA-GáLVEZ A, MIRANDA M, VERGARA J, et al. Nutrition facts and functional potential of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.), an ancient Andean grain: a review[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(15): 2541-2547. DOI:10.1002/jsfa.4158.

[12] 魏愛春, 楊修仕, 么楊, 等. 藜麥營(yíng)養(yǎng)功能成分及生物活性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2015, 36(15): 272-276. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201515050.

[13] 袁俊杰, 蔣玉蓉, 呂柯蘭, 等. 不同鹽脅迫對(duì)藜麥種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 浙江農(nóng)林大學(xué), 2015, 34(8): 9-17. DOI:10.16590/ j.cnki.1001-4705.2015.08.009.

[14] 相啟森, 張麗華, 姜亭亭, 等. 藜麥提取物體外抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(2): 78-81. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.007.

[15] 堀江典子, 菅美奈子, 金武祚. GABA(γ-氨基丁酸)的功能性[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2010(6): 169-173. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2010.06.027.

[16] 許建軍, 江波, 許時(shí)嬰. GABA(γ-氨基丁酸): 一種新型的功能食品因子[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2008, 8(2): 1-4. DOI:10.3969/ j.issn.1002-0306.2003.01.046.

[17] XING S G, YUN Y B, HAU Z W, et al. Higher accumulation of γ-aminobutyric acid induced by salt stress through stimulating the activity of diarnine oxidases in Glycine max (L.) Merr. roots[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2007, 45(8): 560-566. DOI:10.1016/ S0304-4017(99)00207-1.

[18] BOUCHé N, LACOMBE B, FROMM H. GABA signaling: a conserved and ubiquitous mechanism[J]. Trends in Cell Biology, 2003, 13(12): 607-610. DOI:10.1016/j.tcb.2003.10.001.

[19] KATAGIRI M, SHIMIZU S. γ-aminobutyric acid accumulation in bean sprouts (soybean, black gram, green gram) treated with carbon dioxide[J]. Nippon Shokuhin Kagaku Kougaku Kaishi, 1989, 36(11): 916-919. DOI:10.3136/nskkk1962.36.11_916.

[20] GUO Y X, CHEN H, SONG Y, et al. Effects of soaking and aeration treatment on γ-aminobutyric acid accumulation in germinated soybean (Glycine max L.)[J]. European Food Research and Technology, 2011, 232(5): 787-795. DOI:10.1007/s00217-011-1444-6.

[21] 李曉丹, 王莉, 王韌, 等. 金屬鹽離子對(duì)苦蕎萌發(fā)及其總黃酮含量的影響[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2012, 27(10): 26-31. DOI:10.3969/ j.issn.1003-0174.2012.10.006.

[22] MARCO L V, DANIEL G, DANIEL M R, et al. Characterization and quantitation of triterpenoid saponins in raw and sprouted Chenopodium berlandieri spp. (Huauzontle) grains subjected to germination with or without selenium stress conditions[J]. Journal of Food Science, 2016, 81(1): 19-26. DOI:10.1111/1750-3841.13174.

[23] PATTEN G S, ABEYWARDENA M Y, BENNETT L E. Inhibition of angiotensin converting enzyme, angiotensin Ⅱ receptor blocking, and blood pressure lowering bioactivity across plant families[J]. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 2016, 56(2): 181-214. DOI:10.1 080/10408398.2011.651176.

[24] AISHA M, ANUM Z, AMR N, et al. Isolation and characterization of Bradykinin potentiating peptides from Agkistrodon bilineatus venom[J]. Proteome Science, 2016, 14(1):1-9. DOI:10.1186/s12953-016-0090-0.

[25] 宋華曾, 畢琳, 呂順, 等. 鮰魚皮明膠ACE抑制肽降血壓活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(2): 78-83.

[26] 張志清, 徐杰, 叢軍, 等. 高效液相色譜法測(cè)定發(fā)芽麥粒中γ-氨基丁酸(GABA)含量[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2015, 30(11): 135-139. DOI:10.3969/j.issn.1003-0174.2015.11.025.

[27] 鄭鴻雁, 趙煒彤, 昌妍希. 響應(yīng)面法優(yōu)化假絲酵母Y6產(chǎn)γ-氨基丁酸發(fā)酵工藝[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(9):130-135. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201509024.

[28] CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20(7): 1637-1685. DOI:10.1016/0006-2952(71)90292-9.

[29] 許建軍, 江波, 許時(shí)嬰. 谷氨酸脫羧酶(GAD)的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2004, 25(7): 132-133. DOI:10.3969/j.issn.1002-0306.2004.07.054.

[30] 張暉. 米胚谷氨酸脫羧酶性質(zhì)及其富集γ-氨基丁酸研究[D]. 無錫:江南大學(xué), 2004.

[31] 陳紅梅, 謝翎. 響應(yīng)面法優(yōu)化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 45-50. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602008.

Response Surface Optimization of GABA Accumulation in Germinated Quinoa under Citric Acid Stress and Its ACE Inhibitory Activity in Vitro

GUO Xiaomeng1, ZHAO Fushi1, YE Xiaohui1, MA Tingjun1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China; 2. Agricultural Biological Products and Seed Industry of Zhongguancun Open Laboratory, Beijing 100190, China)

This study aimed to optimize the culture conditions for γ-aminobutyric acid (GABA) production in germinated quinoa under citric acid stress. GABA from germinated quinoa was ultrasonically extracted with ethanol and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The optimization of citric acid concentration, culture time and temperature, the factors affecting GABA content in germinated quinoa, were optimized by the combined use of one-factorat-a-time method and response surface methodology. Results indicated that the highest GABA content of 1.538 mg/g in germinated quinoa was obtained after 48 h of culture at 25 ℃ in the presence of 2.00 mmol/L citric acid, which was 3.8 times as high as that observed for the ungerminated sample. The percentage of ACE inhibition by germinated quinoa under citric acid stress was 63%, which was 1.3 and 1.9 times higher than that that by the germinated one without citric acid stress and the ungerminated one, respectively. This finding suggested that germination under citric acid stress could improve the antihypertensive activity of quinoa, which will provide a guideline for further study of quinoa.

quinoa; germination; citric acid stress; γ-aminobutyric acid (GABA); response surface analysis

10.7506/spkx1002-6630-201714034

TS213.2

A

1002-6630（2017）14-0221-06

郭曉蒙, 趙富士, 冶曉惠, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬酸脅迫藜麥富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件及體外降血壓活性研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 221-226.

10.7506/spkx1002-6630-201714034. http://www.spkx.net.cn

GUO Xiaomeng, ZHAO Fushi, YE Xiaohui, et al. Response surface optimization of GABA accumulation in germinated quinoa under citric acid stress and its ACE inhibitory activity in vitro[J]. Food Science, 2017, 38(14): 221-226. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714034. http://www.spkx.net.cn

2016-10-17

2017年內(nèi)涵發(fā)展定額項(xiàng)目—研究生教育改革與發(fā)展項(xiàng)目—科研創(chuàng)新項(xiàng)目；2017年大學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目

郭曉蒙（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取與功能食品。E-mail：15600633600@163.com

*通信作者：馬挺軍（1973—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取與功能食品。E-mail：mtingjun@163.com