陳 穎，王 茉，景莉君，張 寧，陳書(shū)琴，韋英杰＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室 南京 210028；3.中國(guó)人民解放軍93038部隊(duì)醫(yī)院 通化 135300）

基于斑馬魚(yú)模型篩選壯骨關(guān)節(jié)丸毒性藥味高效篩選＊

陳 穎1，2，王 茉3，景莉君1，2，張 寧1，2，陳書(shū)琴1，2，韋英杰1，2＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室 南京 210028；3.中國(guó)人民解放軍93038部隊(duì)醫(yī)院 通化 135300）

目的：采用斑馬魚(yú)模型高效篩選壯骨關(guān)節(jié)丸中有毒性的藥味。方法：將受精后1天（1 day post fertilization，1dpf）的斑馬魚(yú)胚胎暴露于壯骨關(guān)節(jié)丸及方中12種藥味不同濃度水煎液和醇提液中，觀察記錄給藥后2-6 dpf或2-8 dpf的死亡數(shù)量，于3 dpf顯微檢視斑馬魚(yú)幼魚(yú)狀態(tài)，SPSS軟件計(jì)算6 dpf的斑馬魚(yú)半數(shù)致死濃度LC50。結(jié)果：斑馬魚(yú)暴露于壯骨關(guān)節(jié)丸及補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、乳香沒(méi)藥、獨(dú)活和木香的水、醇提取液，以及雞血藤和狗脊的醇提液毒性較大，致魚(yú)卵黃囊腫大、變形或變黑，提示與肝毒相關(guān)，6 dpf魚(yú)的LC50為33.2-392.7 μg·mL-1（已折算為生藥量，下同）；淫羊藿水、醇提取液均在1 500 μg·mL-1致魚(yú)卵黃囊腫大、變黑，LC50為1 100-1 350 μg·mL-1，有一定毒性；雞血藤和狗脊的水煎液，以及骨碎補(bǔ)、桑寄生和熟地黃的水、醇提取液未致魚(yú)臟器明顯改變，LC50大于1 500 μg·mL-1，故安全性較好。結(jié)論：斑馬魚(yú)模型高效辨識(shí)了壯骨關(guān)節(jié)丸不同藥味毒性差異，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜中藥中潛在毒性物質(zhì)的在體、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、規(guī)?；母咝ШY選。

壯骨關(guān)節(jié)丸 斑馬魚(yú) 毒性藥味 肝毒性

近年來(lái)，壯骨中藥的肝毒性引起重視，有些療效確切、臨床用藥廣、關(guān)注度高的知名中成藥如壯骨關(guān)節(jié)丸、仙靈骨葆膠囊等有肝臟不良反應(yīng)，其肝損害不良反應(yīng)已在《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》公開(kāi)[1-3]，為臨床安全用藥帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。高效辨識(shí)其毒性根源具有意義。

現(xiàn)有體內(nèi)、外毒性模型無(wú)法兼顧在體與高效評(píng)價(jià)：哺乳動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大，不適于高效篩選；體外細(xì)胞模型環(huán)節(jié)單一，無(wú)法體現(xiàn)在體效果。斑馬魚(yú)是彌補(bǔ)現(xiàn)有體內(nèi)、外模型不足的理想模式生物，斑馬成魚(yú)個(gè)體小，便于大規(guī)模養(yǎng)殖，養(yǎng)殖成本低，產(chǎn)卵量多，遺傳背景清楚，其基因與人類相比有85%的相似度。斑馬魚(yú)胚胎體外受精，體外發(fā)育，胚胎發(fā)育同步且速度快，可于微板中實(shí)驗(yàn)，已成為國(guó)際上藥物安全性和疾病研究的熱門(mén)模式生物[4-7]。

壯骨關(guān)節(jié)丸為中國(guó)藥典收載，是最早在藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)發(fā)布(2001年第1期和2008年第16期)有肝毒的壯骨中成藥。壯骨關(guān)節(jié)丸的肝毒性雖引起重視[8-9]，但致毒根源研究進(jìn)展較慢，僅見(jiàn)周昆等[10]篩選壯骨關(guān)節(jié)丸中肝毒性藥材研究，采用Beagle犬，按照故障排除法將壯骨關(guān)節(jié)丸全方拆分為最可能組(補(bǔ)骨脂組)、可能組(淫羊藿加獨(dú)活組、乳香加沒(méi)藥組)、最不可能組(熟地組、續(xù)斷加狗脊和雞血藤組、骨碎補(bǔ)加桑寄生和木香組)，初步尋找出其中引起肝損害的藥材組。由于大動(dòng)物Beagle犬實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，成本高等因素，未能實(shí)現(xiàn)對(duì)方中12味藥的毒性分別篩查，難于辨別各藥的毒性強(qiáng)弱。本研究用斑馬魚(yú)高效評(píng)價(jià)方中12味藥的水煎液及醇提物安全性，以期明確壯骨關(guān)節(jié)丸的毒性根源，為深入研究其毒性物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為應(yīng)用模式動(dòng)物斑馬魚(yú)進(jìn)行中藥復(fù)雜體系毒性高效篩選提供參考。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

斑馬魚(yú)成魚(yú)由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，來(lái)自德國(guó)tuebingen品系。

1.2 試藥

壯骨關(guān)節(jié)丸(ZGGJW，華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：1212003S)；狗脊（GJ，四川，安徽井泉中藥飲片）、淫羊藿（YYH，東北，安徽井泉中藥飲片）、獨(dú)活（DH，湖北，南京海源中藥飲片）、骨碎補(bǔ)（GSB，甘肅，安徽井泉中藥飲片）、續(xù)斷（XD，湖北，安徽井泉中藥飲片）、補(bǔ)骨脂（BGZ，云南，南京松齡中藥飲片）、桑寄生（SJS，廣西，亳州市萬(wàn)珍中藥飲片）、雞血藤（JXT，廣西，安徽井泉中藥飲片）、熟地黃（SDH，河南，南京松齡中藥飲片）、木香（MX，云南，南京松齡中藥飲片）、乳香（醋炙）（RX，廣東，亳州萬(wàn)珍中藥飲片廠）、沒(méi)藥（醋炙）（MY，廣西，亳州萬(wàn)珍中藥飲片廠）。以上藥材均來(lái)源于江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科。

1.3 儀器

Nikon Aphaphot-2 YS2顯微鏡(日本Nikon尼康公司)；生化培養(yǎng)箱SPX-80(寧波海曙賽褔實(shí)驗(yàn)儀器廠)，Olypus stylus TG-4相機(jī)（日本Olypus公司）；水為Milli-Q system高純水(Millipore， Bedford， MA，USA)。

2 方法

2.1 供試液制備

壯骨關(guān)節(jié)丸供試液制備：取壯骨關(guān)節(jié)丸，研成粉末，稱取粉末100mg，加入DMSO 0.4 mL助溶，加50 mL培養(yǎng)基稀釋，100℃水浴30min，離心后將藥液定容至50 mL，配制成2 mg·mL-1的母液，臨用前用培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，分別配制成12.5，25，0，100，200， 300，400 μg·mL-1供試液供魚(yú)毒測(cè)試。

水煎液（Water decoction，WD）或醇提液（Ethanol extract，EE）制備：將各藥味分別粉碎，分別稱取3.0-5.0 g（其中乳香沒(méi)藥按1：1稱?。?，加水煎煮或80%乙醇提取2次，每次30分鐘，合并兩次濾液，濃縮至無(wú)醇味，配成10 mg生藥·mL-1貯備液，置-20℃冰箱保存，臨用前用培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，分別配制不同濃度的供試液供魚(yú)毒測(cè)試。另用20 mmol·L-1對(duì)乙酰氨基酚培養(yǎng)基溶液作為肝毒陽(yáng)性對(duì)照。

2.2 斑馬魚(yú)給藥

選取健康雌、雄斑馬魚(yú)成魚(yú)以雌雄自然交配，收集受精卵，于光照培養(yǎng)箱內(nèi)28.5 ℃中發(fā)育，得到1dpf（day post fertilization）的胚胎備用。取斑馬魚(yú)發(fā)育正常的胚胎置24孔板中，每孔6個(gè)胚胎3組，分別暴露于不同濃度的供試液中，每孔2.0mL溶液，用培養(yǎng)基做空白對(duì)照。以卵凝結(jié)、心臟停跳作為死亡終點(diǎn)，每天計(jì)數(shù)胚胎和/或幼魚(yú)死亡數(shù)量至6dpf或8dpf（壯骨關(guān)節(jié)丸），顯微觀察3dpf魚(yú)的形態(tài)并拍照。

2.3 LC50計(jì)算

用Excel軟件對(duì)魚(yú)死亡數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0計(jì)算壯骨關(guān)節(jié)丸中不同藥味對(duì)6dpf的斑馬魚(yú)半數(shù)死亡濃度LC50。

3 結(jié)果

3.1 顯微檢視結(jié)果

斑馬魚(yú)胚胎暴露于壯骨關(guān)節(jié)丸及各藥味不同濃度溶液48h后，在顯微鏡中下觀察并記錄斑馬幼魚(yú)（3dpf）狀態(tài)。

斑馬魚(yú)暴露壯骨關(guān)節(jié)丸2天后，50 ug·mL-1魚(yú)臟器形態(tài)與培養(yǎng)基組相當(dāng)，未見(jiàn)明顯毒性，100 ug·mL-1及以上濃度壯骨關(guān)節(jié)丸的幼魚(yú)心包略腫大、出血，卵黃囊腫大、變形嚴(yán)重，色變黑（圖1）。

各藥味組魚(yú)與培養(yǎng)對(duì)照組斑馬幼魚(yú)相比，發(fā)現(xiàn)水煎液和醇提液毒性均較大的有補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、乳香沒(méi)藥、獨(dú)活和木香，呈現(xiàn)不同程度的臟器中毒現(xiàn)象，如卵黃囊腫大、畸形、變黑，心包腫大、出血、脊柱彎曲或色斑減少等，中毒濃度在15～500 μg生藥·mL-1，值得注意的是補(bǔ)骨脂醇提液毒性遠(yuǎn)大于水煎液，醇提液致魚(yú)中毒濃度約為水煎液的1/6至1/8，而續(xù)斷水煎液的毒性遠(yuǎn)大于醇提液，醇提液致魚(yú)中毒濃度約為水煎液的33倍；淫羊藿水煎液和醇提液均在1500 μg生藥·mL-1致魚(yú)卵黃囊腫大、變黑；雞血藤與狗脊的水煎液安全性好，未見(jiàn)魚(yú)臟器明顯改變，但醇提液均有較大毒性，雞血藤致魚(yú)胚胎不能正常孵化，狗脊在500 μg生藥·mL-1時(shí)心包腫大，出血，卵黃囊腫大、變黑。骨碎補(bǔ)、桑寄生、熟地黃水煎液和醇提液均未致魚(yú)臟器明顯改變（圖1）。

圖1 斑馬魚(yú)(3dpf)暴露壯骨關(guān)節(jié)丸及各藥味的顯微檢視照片

3.2 各藥味對(duì)斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)至死率結(jié)果

觀察并記錄斑馬魚(yú)胚胎暴露于各濃度溶液2-6dpf的死亡數(shù)，計(jì)算死亡率，發(fā)現(xiàn)壯骨關(guān)節(jié)丸及各藥味致斑馬魚(yú)死亡率與給藥濃度和時(shí)間密切相關(guān)（圖2）。1dpf斑馬魚(yú)暴露壯骨關(guān)節(jié)丸2-3天后，100-400 μg·mL-1組魚(yú)全部死亡，12.5-50.0 μg生藥·mL-1組魚(yú)給藥期間至1dpf少量（小于10%）或未見(jiàn)死亡。1dpf斑馬魚(yú)暴露各藥味后，致魚(yú)臟器毒性大的幾種藥味致魚(yú)全部死亡的濃度較低，補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、乳香沒(méi)藥、獨(dú)活和木香水煎液致魚(yú)100%死亡的濃度范圍分別500、20-100、150-1 000，500-1 000 和500-1 000 μg生藥·mL-1，醇提液致魚(yú)100%死亡的濃度分別40-80、200-1 000、100-1 000，500-1 000 和500-1 000 μg生藥·mL-1，可見(jiàn)補(bǔ)骨脂醇提液和續(xù)斷水煎液毒性分別遠(yuǎn)大于補(bǔ)骨脂水煎液和續(xù)斷醇提液，濃度差8-10倍；淫羊藿水煎液和醇提液最大給藥濃度2 000 μg生藥·mL-1致魚(yú)死亡率分別為87.5%和100%，而骨碎補(bǔ)相同濃度致魚(yú)死亡率低于70%；雞血藤和狗脊的醇提液毒性均大于水煎液，致魚(yú)全部死亡的濃度范圍均為500-4 000 μg生藥·mL-1，而其水煎液最大給藥濃度（3 000和4 000 μg生藥·mL-1）均未見(jiàn)魚(yú)100%死亡；桑寄生、熟地黃水煎液和醇提液致魚(yú)100%死亡最小濃度均大于3 000 μg生藥·mL-1，安全性較好。

圖2 壯骨關(guān)節(jié)丸及各藥味水煎液和醇提液致斑馬魚(yú)死亡的時(shí)-量-毒關(guān)系

圖2 壯骨關(guān)節(jié)丸及各藥味水煎液和醇提液致斑馬魚(yú)死亡的時(shí)-量-毒關(guān)系

續(xù)圖2 壯骨關(guān)節(jié)丸及各藥味水煎液和醇提液致斑馬魚(yú)死亡的時(shí)-量-毒關(guān)系

圖3 各藥味水煎液和醇提液的斑馬魚(yú)（3dpf和6dpf）半數(shù)死亡濃度LC50值

SPSS16.0計(jì)算3dpf和6dpf魚(yú)的各藥水煎液和醇提液的半數(shù)致死濃度LC50（圖3），對(duì)于少量死亡未能計(jì)算LC50值的暫以最大給藥濃度計(jì)，各藥3dpf和6dpf的LC50大小趨勢(shì)變化不大，值得注意的是雞血藤醇提液6dpf時(shí)LC50值顯著降低，僅約為3dpf時(shí)LC50值的1/10，提示雞血藤醇提液對(duì)斑馬魚(yú)胚胎毒性低于對(duì)幼魚(yú)毒性。兼顧醇提液和水煎液的LC50值由小到大，綜合考慮魚(yú)臟器毒性變化，可初步推測(cè)各藥味魚(yú)毒性由大到小順序?yàn)椋貉a(bǔ)骨脂、續(xù)斷、乳香沒(méi)藥、木香和獨(dú)活的毒性較大；其次雞血藤醇提液和狗脊醇提液及淫羊藿有一定毒性；骨碎補(bǔ)的LC50值與淫羊藿相近，但高濃度2 000 μg生藥·mL-1組魚(yú)未見(jiàn)明顯臟器改變，提示相對(duì)安全；雞血藤水煎液、狗脊水煎液、桑寄生和熟地黃安全性好。

4 討論

本文針對(duì)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物毒性模型難于高效篩選復(fù)雜有毒中藥如壯骨關(guān)節(jié)丸的致毒根源，采用斑馬魚(yú)毒性模型快速評(píng)價(jià)了壯骨關(guān)節(jié)丸及各藥味水煎液和醇提液的毒性差異，主要考查了1dpf胚胎至6dpf幼魚(yú)的臟器形態(tài)和死亡率。

斑馬魚(yú)毒性模型是近年來(lái)被國(guó)內(nèi)、外廣泛關(guān)注并認(rèn)可的藥物安全性高效評(píng)價(jià)模型，斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育快，受精后3天（3dpf）心臟等臟器基本發(fā)育完全孵出，3dpf斑馬幼魚(yú)剛孵出不易動(dòng)，魚(yú)體透明，易于在顯微鏡下側(cè)臥檢視卵黃囊、心臟等臟器形態(tài)，4dpf后斑馬魚(yú)活躍，5dpf肝臟發(fā)育完全，卵黃囊不斷被吸收，不易側(cè)臥捕獲臟器形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)觀察1dpf-6dpf的毒性，旨在兼顧試藥對(duì)胚胎發(fā)育及幼魚(yú)的影響。斑馬魚(yú)卵黃囊成分的70%為中性脂質(zhì)，主要在肝臟中代謝，因此卵黃囊大小可作為反映肝功能的指標(biāo)之一[11， 12]。

本實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)驗(yàn)證了壯骨關(guān)節(jié)丸毒性，并發(fā)現(xiàn)有些傳統(tǒng)認(rèn)為相對(duì)安全的藥味對(duì)魚(yú)具有明顯毒性：壯骨關(guān)節(jié)丸（100-400 μg·mL-1）及補(bǔ)骨脂、續(xù)斷、乳香沒(méi)藥、獨(dú)活和木香的水、醇提取液，以及雞血藤和狗脊的醇提液在較低濃度（17.5-400 μg生藥·mL-1），淫羊藿水、醇提取液（1 500 μg生藥·mL-1）致3dpf斑馬魚(yú)卵黃囊腫大、變形或變黑，提示與肝毒相關(guān)，且上述各藥（除淫羊藿外）6dpf魚(yú)的LC50值較小（33.2-392.7 μg生藥·mL-1），提示毒性較大，值得注意的是補(bǔ)骨脂醇提液毒性明顯大于水煎液，續(xù)斷水煎液的毒性明顯大于醇提液。其中有的藥味毒性已引起重視，但現(xiàn)有研究尚不夠深入，如補(bǔ)骨脂、淫羊藿、乳香、沒(méi)藥、木香和獨(dú)活[2，13-21]，續(xù)斷的毒性尚未見(jiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。另發(fā)現(xiàn)雞血藤和狗脊醇提液毒性較大，而水煎液則安全性好；桑寄生、熟地黃和骨碎補(bǔ)的醇提液和水煎液的安全性均較好。

本實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)全面考查了壯骨關(guān)節(jié)丸中12種藥味安全性，其中乳香、沒(méi)藥常配對(duì)入藥合并為一種，其它藥味均單獨(dú)測(cè)試，考慮到部分藥味打粉入藥[23]，每種藥味均設(shè)水煎液和醇提液組，并分別設(shè)5-8個(gè)劑量濃度，樣本量大，難于用大鼠和狗高效評(píng)價(jià)，而斑馬魚(yú)毒性模型可在微板中實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，實(shí)現(xiàn)高靈敏、低成本、高效率、規(guī)?；Y選，為快速發(fā)現(xiàn)復(fù)雜中藥毒性根源提供了有力支撐和有益參考。

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22 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部). 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)出版社, 2015：863-864.

Efficient Screen of Toxic Herbal Medicine in Zhuang Gu Guan Jie Pill Based on Zebrafish Model

Chen Ying1,2, Wang Mo3, Jing Lijun1,2, Zhang Ning1,2, Chen Shuqin1,2, Wei Yingjie1,2
(1. The Third Clinical School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China; 2. Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Materia Medica, Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China; 3. The Chinese People's Liberation Army (PLA) 93038 Army Hospital, Tonghua 135300, China)

This study aimed at efficiently screening out the toxic herbal medicines in Zhuang Gu Guan Jie pill (ZGGJ) based on the zebrafish model. Zebrafish embryos at 1 day post fertilization (dpf) were administered by ZGGJ and the water decoction (WD) and ethanol extract (EE) of 12 herbal drugs in it with various concentrations. The number of embryo deaths after the administration was recorded at 2-6 dpf and 2-8 dpf， respectively. Embryonic micro-morphology of zebrafish (3 dpf) was observed， LC50value at 6 dpf was calculated by SPSS16.0. As a result， both the WD and EE of ZGGJ， fructus psoraleae， radix dipsaci， olibanum， myrrh， radix angelicae pubescentis and aucklandiae radix， and the EE of Caulis Spatholobo and Rhizoma Cibotii presented high organ toxicity to the juvenile zebrafish， featuring yolk sac swelling， deforming， blackening， indicating hepatotoxicity in the zebrafish. Their LC50value at 6 dpf was from 33.2 μg·mL-1to 392.7 μg·mL-1(LD50value was converted to crude drug. The same bellow.). The WD and EE of Epimedii Folium at 1，500 μg·mL-1led to yolk sac swelling and blackening. The LC50at 6 dpf varied at 1，100-1，350 μg·mL-1， showing a certain toxicity of Epimedii Folium. The WD of Caulis Spatholobo and Cibotii Rhizoma and both WD and EE of Rhizoma drynariae， taxilli herba and prepared rehmanniae radix didn’t change the toxicity to the organs in zebrafish. LC50value were over 1，500 μg·mL-1， presenting favorable safety. In conclusion， it was demonstrated that the zebrafish model efficiently identified the toxicity of different herbal medicines from ZGGJ and efficiently screened out the potential toxicants in vivo with the advantages of real-time， dynamic and large scale for traditional Chinese medical compounds.

Zhuang Gu Guan Jie pill， zebrafish， toxicity of herbal medicine， hepatotoxicity

10.11842/wst.2017.01.020

R285.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-12-23

修回日期：2017-01-13

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81573833）：基于三維M-Act/Tox協(xié)同評(píng)價(jià)的抗骨質(zhì)疏松中藥篩選新方法的建立與應(yīng)用，負(fù)責(zé)人：韋英杰；江蘇省科技廳自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20141507）：基于斑馬魚(yú)M-Act/Tox一體化評(píng)價(jià)的中藥抗骨質(zhì)疏松篩選新方法與應(yīng)用，負(fù)責(zé)人：韋英杰；江蘇省人才工作領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室2014年度江蘇省第四期“333工程”科研資助項(xiàng)目（RA2014348）：基于斑馬魚(yú)毒/效同步評(píng)價(jià)的抗骨質(zhì)疏松篩選中藥新技術(shù)與應(yīng)用，負(fù)責(zé)人：韋英杰；江蘇省人力資源和社會(huì)保障廳江蘇省第十批“六大人才高峰”（2013-YY006）：以二維斑馬魚(yú)模型聯(lián)合色譜聯(lián)用技術(shù)高效篩選中藥抗骨質(zhì)疏松體內(nèi)外活性成分，負(fù)責(zé)人：韋英杰。

＊＊ 通訊作者：韋英杰，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制研究。