蔡展宇　蘇廣華

摘要：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模涸谛∥埠虻男竽翗I(yè)良種繁育中，探索液氮?dú)庀啻鎯?chǔ)技術(shù)應(yīng)用于胚胎玻璃化冷凍的可行性。實(shí)驗(yàn)方法：采用小尾寒羊母羊作為胚胎的供體，利用超數(shù)排卵技術(shù)和體外輸精之后，并且胚胎在供體羊體內(nèi)發(fā)育的7天之后，將胚胎沖出。之后，利用新的玻璃化冷凍技術(shù)對(duì)所采集的胚胎進(jìn)行冷凍處理，冷凍處理24小時(shí)之后復(fù)蘇，之后移植同期發(fā)情蒙古母羊受體體內(nèi)，并且以鮮胚移植同批發(fā)情母羊受體作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：玻璃化胚胎移植的妊娠率與胚胎的發(fā)育的不同階段密切相關(guān)（fisher精確檢驗(yàn)：p=0.01 8），CH（緊縮桑葚胚）的懷孕率顯著高于BL（囊胚期）。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：在氣相液氮存儲(chǔ)條件下，羊胚胎玻璃化冷凍采用緊縮桑葚期胚胎，能提高妊娠率。

關(guān)鍵詞：胚胎移植；玻璃化；液氮蒸汽相存儲(chǔ)；低溫生物學(xué)

低溫保存胚胎技術(shù)是優(yōu)良種畜生育和種群擴(kuò)大的重要組成技術(shù)。從1985年Rail和Fahv使用玻璃化冷凍法成功地冷凍了小鼠胚胎（Rall&Fahv 1985）以來(lái)，玻璃化已成為常規(guī)的低溫動(dòng)物胚胎保存技術(shù)之一，廣泛用于動(dòng)物和人的胚胎保存中。玻璃化形成于-80℃--130℃，在這個(gè)轉(zhuǎn)變溫度以下，分子運(yùn)動(dòng)和化學(xué)轉(zhuǎn)化都會(huì)停止，胚胎等生物樣品可以無(wú)限期地保存，因此是種群保存、動(dòng)物基因克隆建庫(kù)、運(yùn)輸和胚胎移植等應(yīng)用的有效手段（Woods，Benson，Agca&Critser，2004）。在當(dāng)前的玻璃化冷凍技術(shù)中，胚胎等生物活性-樣品通常被儲(chǔ)存在液氮液體內(nèi)，溫度是-196℃，大大低于玻璃化形成所需要的溫度，液氮液體存儲(chǔ)具有價(jià)格低廉并普及的優(yōu)點(diǎn)。然而，液氮蒸氣相中同樣可以實(shí)現(xiàn)低溫樣品的保存，被稱(chēng)為氣相存儲(chǔ)，目前已有很多商品化的液氮?dú)庀啻鎯?chǔ)裝置可供選擇。液氮?dú)庀啻鎯?chǔ)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）可避免共處一個(gè)液氮池中的各樣品之間發(fā)生潛在的相互污染以及防止傳染介質(zhì)在其中的傳播；2）由于存儲(chǔ)溫度在-130℃--150℃，長(zhǎng)期存儲(chǔ)可以節(jié)約液氮的使用，從而降低成本提高經(jīng)濟(jì)效益；3）可以防止樣品的碎裂現(xiàn)象發(fā)生，在玻璃化冷凍中有一個(gè)問(wèn)題是碎裂，這通常發(fā)生在較大的樣品中（mL體積以上），碎裂會(huì)發(fā)生在大幅低于玻璃體形成溫度的以下溫度，例如液氮液體溫度（-196℃）。防止樣品碎裂發(fā)生要求生物樣品存儲(chǔ)的溫度保持在玻璃體形成溫度以下10攝氏度到20攝氏度之內(nèi)，例如：-130℃到-150℃之間，這就要求進(jìn)行氣相存儲(chǔ)。我們?cè)O(shè)計(jì)并制作了一種恒定溫度在-140.5℃的液氮?dú)庀啻鎯?chǔ)裝置，在此次試驗(yàn)中玻璃化冷凍小尾寒羊供體的胚胎，在本次實(shí)驗(yàn)證明有效，并申請(qǐng)了專(zhuān)利保護(hù)。

目前，對(duì)于在液氮?dú)庀嗖ＡЩ鋬鼍d羊胚胎并應(yīng)用于胚胎移植，報(bào)道和研究較少，我們?cè)O(shè)計(jì)進(jìn)行這種玻璃化胚胎冷凍的試驗(yàn)，同時(shí)使用鮮胚移植作為陽(yáng)性對(duì)照，以驗(yàn)證試驗(yàn)方法及試驗(yàn)過(guò)程的可靠性，探索液氮?dú)庀啻鎯?chǔ)玻璃化冷凍在綿羊胚胎移植中應(yīng)用技術(shù)。通過(guò)對(duì)小尾寒羊在氣相液氮裝置進(jìn)行胚胎玻璃化冷凍，解凍后進(jìn)行胚胎移植，為綿羊優(yōu)良種畜生育和種群擴(kuò)大探索新的低溫技術(shù)，最終為胚胎移植技術(shù)的改進(jìn)和低溫冷凍設(shè)施的改良奠定基礎(chǔ)。這對(duì)于綿羊的良種育種和良種擴(kuò)大，都有很大意義。

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以30只小尾寒羊作為供體以三種FSH（卵泡刺激素），分別為加拿大（Canada），寧波（Ningbo）和中科院（CAS）進(jìn)行超排卵，并進(jìn)行人工授精。120只蒙古羊同期發(fā)情作為胚胎移植受體。沖洗取出受精的胚胎，按形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胚胎分級(jí)。取50枚胚胎進(jìn)行氣相條件下玻璃化冷凍，并在自制的液氮?dú)庀嘌b置中溫度控制在-140℃過(guò)夜，24h后解凍，并且移植25只蒙古羊，每只羊移植兩枚胚胎。作為對(duì)照組，以50枚新鮮采集的胚胎移植另外25只蒙古羊作為陽(yáng)性對(duì)照組，同樣每羊移植2枚新鮮采集的胚胎。

1.2氣相液氮裝置的制備：

所用裝置按本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和制作，存儲(chǔ)空間為液氮的蒸汽相（氣相），可以保證實(shí)現(xiàn)存儲(chǔ)室的溫度不超過(guò)-140.5℃的溫度范圍，有效克服氣相冷凍裝置溫度變化大的缺點(diǎn)。進(jìn)行驗(yàn)證后，此裝置已被申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利，發(fā)明名稱(chēng)：恒定低溫存儲(chǔ)系統(tǒng)及去除杜瓦霧氣的方法。申請(qǐng)?zhí)枮椋篊N201710024975.1

注：在過(guò)夜玻璃化冷凍所存儲(chǔ)的胚胎中，x軸為時(shí)間從凌晨0：00到下午16：48的溫度監(jiān)控。Y軸為溫度變化。如圖所示：T Bottom為氣相存儲(chǔ)室底部的溫度探頭所檢測(cè)到的溫度，T Top為氣相存儲(chǔ)室頂部的探頭所測(cè)溫度，T Center為氣相存儲(chǔ)室中部的探頭所測(cè)溫度；以上溫度探頭均為OMEGA的熱電偶，Tc為RTD類(lèi)型的溫度探頭。Tset（PID）proportional-integral-derivative控制器作為本裝置的控制單元。PID單元的控制溫度加上一個(gè)補(bǔ)償值來(lái)和實(shí)際溫度相一致。

1.3主要藥品：

羊用同期發(fā)情陰道栓（CIDRG，20枚/包新西蘭），Controlled drug release dispenser，簡(jiǎn)稱(chēng)CIDR。供體用CIDR+LH+FSH進(jìn)行同期發(fā)情和超數(shù)排卵，受體用CIDR+LH進(jìn)行同期發(fā)情；中科院動(dòng)物所生產(chǎn)的FSH，規(guī)格10mg/瓶；加拿大Bioniche公司生產(chǎn)的FSH，規(guī)格為400mg（20mL）/盒；寧波激素制品廠生產(chǎn)，規(guī)格為100IU/支。促黃體素（LH）為寧波激素制品廠生產(chǎn)，規(guī)格為200IU/支。胚胎培養(yǎng)保持液（Complete Embryo holding medium 100ml/瓶，新西蘭）、供體羊沖卵用營(yíng)養(yǎng)液（Complete Embryo flush solution，1000 ml/袋，新西蘭）。

1.4試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)：

試驗(yàn)于2016年3月～6月進(jìn)行，牧區(qū)為內(nèi)蒙古呼和浩特和羊牧場(chǎng)。同期發(fā)情、超數(shù)排卵、配種和胚胎收集也都在和羊牧場(chǎng)進(jìn)行，方法按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行（Gibbons A.，Gueto M.，2011）。對(duì)120只蒙古羊進(jìn)行同期發(fā)情處理作為胚胎移植的受體羊，在2016年3月27日-28號(hào)總計(jì)采集到147枚可供移植的胚胎，其中，對(duì)3月27日采集的56枚胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍處理，剩余胚胎在3月28日進(jìn)行采集，作為對(duì)照，進(jìn)行鮮胚移植。

1.5方法

1.5.1供體羊超數(shù)排卵

在內(nèi)蒙古呼和浩特市郊區(qū)和羊牧場(chǎng)，選取30只小尾寒羊作為供體，以三種FSH（卵泡刺激素），分別為加拿大（Canada），寧波（Ningbo）和中科院（CAS）。供體均采用陰道栓誘導(dǎo)同期發(fā)情。在放栓第11d撤栓，分別注射三種FSH。本研究第1次注射總劑量為138 u，分6次遞減注射（28、28、23、23、18、18 u），每天上午、下午各注射1次。在第5次、第6次注射之問(wèn)注射1次LH（80-130 U）。

1.5.2供體羊人工輸精

超排處理后發(fā)情當(dāng)日，將使用假陰道法采集的同種公羊精液稀釋4倍，使用腹腔內(nèi)子宮角輸精技術(shù)，將0.25 ml稀釋精液輸入供體子宮角前端。

1.5.3沖胚及胚胎質(zhì)量認(rèn)定

在人工腹腔鏡輸精后的第7 d進(jìn)行沖胚。手術(shù)前，清洗供體羊手術(shù)部位并剃除腹部細(xì)毛，實(shí)施麻醉，腹中線一側(cè)手術(shù)切口，暴露子官角及卵巢，在確認(rèn)黃體出現(xiàn)之后按照子宮沖胚的方法進(jìn)行沖胚。之后，在體視鏡下對(duì)沖出的囊胚進(jìn)行分級(jí)（0verstrom 1996），分為CM（（compacted morula）緊縮桑葚胚、BL（blastocyte）囊胚、ExB（Expanded Blastocyte）擴(kuò)大囊胚、以及HB孵化囊胚（hatched blastocyst）和未受精等。

1.5.4玻璃化冷凍胚胎和復(fù)蘇方法

選取三個(gè)發(fā)育階段的胚胎fCM，ExB，BL）進(jìn)行玻璃化冷凍：采用含有20%乙二醇（ethylene glycol，EG）+20%二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide.DMSO）的L-15溶液做為玻璃化冷凍的濃儲(chǔ)液。將選取的胚胎依次移人4℃的含有25%、50%、75%和100%濃度用L-15稀釋的玻璃化冷凍濃儲(chǔ)液中各2.5 min，最后將胚胎裝進(jìn)含有100%的胚胎玻璃化冷凍濃儲(chǔ)液的胚胎冷凍管中，之后移入到我們自主研發(fā)的-140.5℃的氣相恒溫罐當(dāng)中。復(fù)蘇時(shí)，在儲(chǔ)存罐中取出胚胎，迅速將其投入室溫的水浴當(dāng)中，當(dāng)液體完全溶解之后，將其依次轉(zhuǎn)移到含有0.5，0.25和0.125 mol/L蔗糖的L-15溶液中各5min，之后放入培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)箱中靜置備用。

1.5.5胚胎移植

用自制輸卵器將7日齡的囊胚移植到經(jīng)同期發(fā)情處理后的蒙古羊作為受體羊的子官角前1/3處，移植后注射1ml黃體酮。對(duì)3月27日采集到的56個(gè)胚胎在特制的液氮?dú)庀嗬鋬鲅b置中進(jìn)行玻璃化冷凍，過(guò)夜后于3月28日對(duì)經(jīng)過(guò)玻璃化冷凍的胚胎進(jìn)行解凍處理，其中50枚胚胎在解凍后，采用腹腔手術(shù)法移植A25只發(fā)情處理的蒙古母羊體內(nèi)，每羊兩枚胚胎。作為對(duì)照組，挑選50枚新鮮采集的小尾寒羊的胚胎移植到25只發(fā)情處理的蒙古母羊體內(nèi)，采用同樣手術(shù)方法，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心同一支研究隊(duì)伍進(jìn)行手術(shù)操作。方法參照Gibbons&Gueto，201 1進(jìn)行。

1.5.6妊娠觀察

胚胎移植后三個(gè)月之內(nèi)采用B超方法確認(rèn)懷孕。在胚胎移植后6個(gè)月隨訪確認(rèn)無(wú)流產(chǎn)和畸形胚胎的產(chǎn)生。

1.5.7統(tǒng)計(jì)分析：

統(tǒng)計(jì)采用Fisher精確檢驗(yàn)。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1在對(duì)照組（鮮胚移植）懷孕率為80%，在玻璃化冷凍胚胎組，懷孕率為38%

2.2胚胎移植的懷孕率

·縮寫(xiě)：CM：緊縮桑葚胚；B：胚囊期；ExB：擴(kuò)大胚囊期

·耳號(hào)為9029 and 9015分別被接種了1只和3只緊縮桑葚胚，并且都成功受孕

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)論

玻璃化胚胎移植的懷孕率與胚胎的發(fā)育階段密切相關(guān)（fisher精確檢驗(yàn)：p=0.018），在CM（緊縮桑葚胚）的懷孕率顯著高于BL（囊胚期）。在液氮?dú)庀嗖ＡЩ鋬鲋?，CM胚胎對(duì)于玻璃化過(guò)程及其融化過(guò)程和高濃度的玻璃化保護(hù)液具有較高的耐受性，后期的受體羊的妊娠情況明顯優(yōu)于其他時(shí)期。鮮胚的胚胎移植成功率高于液氮?dú)庀嗬鋬雠咛?。這同文獻(xiàn)記載相一致。液氮蒸氣相玻璃化胚胎進(jìn)行移植的懷孕成功率與液氮液相玻璃化胚胎的懷孕成功率相似。鑒于液氮?dú)庀嗖ＡЩ鎯?chǔ)的優(yōu)點(diǎn)，氣相玻璃化冷凍技術(shù)在動(dòng)物良種繁育中是一種很有競(jìng)爭(zhēng)力的選擇。

3.討論

使用玻璃化技術(shù)進(jìn)行胚胎冷凍，可以有效降低種羊繁育成本，對(duì)綿羊的優(yōu)良種群進(jìn)行擴(kuò)繁有很大意義。本實(shí)驗(yàn)在內(nèi)蒙古和羊牧場(chǎng)由同一支研究隊(duì)伍對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行操作，有效避免了不同方法和不同手術(shù)操作引入的試驗(yàn)誤差。本實(shí)驗(yàn)中新鮮胚胎的移植達(dá)到80%的受孕率，這與國(guó)外的相關(guān)報(bào)道相一致（Gibbons&Gueto，2011）。使實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其它研究報(bào)道相互印證，具有較高的可信度。

在高等哺乳動(dòng)物的桑葚期的胚胎可分以被為早期、中期和晚期三個(gè)階段。早期桑葚階段，胚胎細(xì)胞似有相互‘融合”（compact）之勢(shì)，但單個(gè)細(xì)胞仍可辨認(rèn)，被稱(chēng)為緊縮桑葚胚（CM）；到了桑葚胚中期，胚胎細(xì)胞進(jìn)行“融合”，形成一個(gè)大而圓的細(xì)胞球（morula），細(xì)胞膜的界限不再清晰，低倍鏡下整個(gè)胚胎看似一個(gè)大細(xì)胞，稱(chēng)為桑葚胚；晚期桑葚胚的細(xì)胞界限重新顯現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)量較“融合”前明顯增多，部分細(xì)胞尤其是周邊細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞之間可出現(xiàn)小腔隙，形成初期的囊胚腔即早期囊胚。有研究認(rèn)為桑葚胚玻璃化冷凍在妊娠率和胚胎種植率達(dá)到了卵裂期胚胎水平，在胚胎種植率方面并優(yōu)于卵裂期胚胎。并具有很多優(yōu)點(diǎn)：如具有細(xì)胞骨架，易于冷凍保護(hù)劑滲透，經(jīng)過(guò)4天培養(yǎng)，可以剔除無(wú)潛力胚胎、降低篩選的工作量，且不需要人工皺縮等，桑葚期胚胎的冷凍較囊胚冷凍經(jīng)濟(jì)、方便，在冷凍胚胎的移植中值得推廣（曹金鳳等，2013）。由于各地采用的供體和受體的品種、年齡、體況各異，操作技術(shù)及試驗(yàn)條件不同，所以移植結(jié)果有所不同（王銳等，2005）。對(duì)于琉璃化冷凍羊胚胎的移植效果也有不同的水平。道賽特等綿羊凍胚移植中，囊胚的受胎率顯著高于桑葚胚（王麗娟，2003）。在杜泊羊上，囊胚的受胎率顯著高于桑葚胚（陳永昌，2004）一般認(rèn)為處于桑葚胚前的胚胎的移植效果好、受胎率較高。但本研究中，以蒙古羊受體，小尾寒羊的桑葚胚移植受胎率高于囊胚期，和其它一些研究結(jié)果相一致（吐?tīng)柡?阿木提等，2016）。

目前已有高質(zhì)量的商業(yè)化綿羊凍胚移植服務(wù)，成功率約為40%左右（奧群牧業(yè)n.a.），本次玻璃化冷凍胚胎的移植總體成功率38%略低于這—水平。但是商品化運(yùn)營(yíng)的胚胎移植，選用移植成功率較高階段的胚胎（如桑葚胚和囊胚期）進(jìn)行玻璃化冷凍和解凍。而在本試驗(yàn)研究中，以緊縮桑葚胚的移植受孕率則高于這一數(shù)字，達(dá)到48%，說(shuō)明氣相液氮裝置在玻璃化冷凍胚胎的受孕成功率可以達(dá)到商業(yè)化胚胎移植的水平。也論證了此種氣相液氮裝置應(yīng)用于綿羊胚胎玻璃化冷凍的可行性。

本試驗(yàn)選用三種FSH進(jìn)行對(duì)比，對(duì)于胚胎超排而言無(wú)顯著差異，證實(shí)寧波產(chǎn)FSH適用于冷凍羊胚胎的移植。通過(guò)進(jìn)一步完善相關(guān)操作流程，及羊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)條件，玻璃化胚胎的移植成功率應(yīng)當(dāng)還有進(jìn)一步的提升空間。