袁 寧， 許宏偉， 劉學(xué)軍

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子-173G/C基因多態(tài)性分布及其與腦梗死關(guān)系的研究

袁 寧1，2， 許宏偉1， 劉學(xué)軍2

目的 探討巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)-173G/C基因多態(tài)性及其與腦梗死關(guān)系。 方法 篩選298例腦梗死患者及203例健康人群為研究對(duì)象，用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法檢測(cè)MIF基因-173G/C多態(tài)性在腦梗死組和正常對(duì)照組的基因頻率。結(jié)果 腦梗死組和對(duì)照組存在MIF基因-173G/C多態(tài)性，但MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無(wú)顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)。兩種等位基因頻率兩組相比亦無(wú)顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)。結(jié)論 MIF -173G/C多態(tài)性可能與腦梗死發(fā)生無(wú)關(guān)，G/C等位基因可能不是腦梗死發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

腦梗死； 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子； 基因； 多態(tài)性

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)于1966 年分別由Bloom和David兩組科學(xué)家在用豚鼠進(jìn)行遲發(fā)性超敏反應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，是機(jī)體內(nèi)一種重要的細(xì)胞因子。其能促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥局部的聚集、增生、活化，增強(qiáng)其粘附、吞噬作用，促進(jìn)分泌一些細(xì)胞因子，如IL-1、TNF-a、NO等，從而間接增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能，并能抵消皮質(zhì)類固醇激素對(duì)其它炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的免疫抑制作用，在機(jī)體的全身和局部炎癥及免疫反應(yīng)中起著重要的作用[1]。而炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化從起始發(fā)病到出現(xiàn)臨床事件都發(fā)揮重要作用的認(rèn)識(shí)已獲得廣泛認(rèn)同，研究表明：血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化部位的MIF表達(dá)水平明顯上調(diào)，且隨著斑塊的發(fā)展逐漸上升；相反，阻斷MIF的表達(dá)則可以顯著延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展并穩(wěn)定斑塊。盡管發(fā)現(xiàn)MIF在多種炎性疾病和動(dòng)脈粥樣硬化患者組織和血液中表達(dá)變化，但對(duì)于其基因多態(tài)性與健康人及患者中MIF表達(dá)的關(guān)系認(rèn)識(shí)卻很少。本文就MIF -173G/CSNPS與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系展開研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集腦梗死患者298例，平均年齡(64.48±11.48)歲，經(jīng)臨床及 CT和(或)磁共振成像(MRI)確診(依照第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn))，排除心律失常、動(dòng)脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤等引起的腦出血；排除肝、腎疾病、自身免疫性疾病、妊娠者、半年內(nèi)曾有降脂治療者。對(duì)照組為健康體檢者共203例，平均年齡(61.27±7.80)歲，無(wú)血緣關(guān)系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物 MIF -173G/C的PCR引物參照文獻(xiàn)[2]，序列為PCR1：上游引物：5’-ACT-AAG-AAA-GAC-CCGAGGC-3；下游引物：5’-GGG-GCA-CGTTGG-TGT-TTA-C-3’；上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 DNA的制備及PCR擴(kuò)增，基因型分析 (1)基因組 DNA的制備：采外周靜脈血 2～3 ml用明膠沉淀紅細(xì)胞，提取白細(xì)胞后用酚/氯仿抽提基因組DNA。(2)目的基因的 PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃充分延伸10 min。最后置于4 ℃終止反應(yīng)。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)內(nèi)觀察(4)酶切產(chǎn)物識(shí)別：MIF-173G/C多態(tài)性由內(nèi)切酶Alu I識(shí)別，37 ℃消化10 h。然后均用瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳分離，紫外燈下照相后閱讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部資料均用SPSS 13.0 for windows軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

研究對(duì)象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，并以比值比(OR)和95%可信區(qū)間(CI)表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。計(jì)量資料指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者組間比較用t檢驗(yàn)，3組及3組以上比較用方差分析；不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死組與對(duì)照組的臨床數(shù)據(jù)比較 將腦梗死組患者與對(duì)照組進(jìn)行一般數(shù)據(jù)的比較，兩組在年齡、性別、吸煙史、飲酒史方面均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 腦梗死組與對(duì)照組的一般數(shù)據(jù)比較

注：*代表與對(duì)照組相比P<0.05

2.2 MIF-173G/C 多態(tài)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切圖譜分析 MIF-173G/C多態(tài)位點(diǎn)可被限制性內(nèi)切酶Alu I識(shí)別。酶切后產(chǎn)生三種基因型：純合子 GG、CC，雜合子 GC(見(jiàn)圖1、圖2)。

2.3 MIF-173G/C基因多態(tài)分布 CI組和對(duì)照組都有GG、GC、CC三種基因型，在研究總?cè)巳褐?CI組+對(duì)照組)中的頻率分別為：62.28%，32.73%，4.99%；等位基因G、C的頻率分別為78.64、21.36。按Hardy-Weinberg平衡定律對(duì)研究人群進(jìn)行了平衡檢驗(yàn)(P>0.05)，證明我們選擇的總研究人群基因頻率能夠代表群體的基因分布。

因CC基因型與GC基因型數(shù)量較少，將之合并為C等位基因攜帶者組，組間比較結(jié)果顯示：MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無(wú)顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)。兩種等位基因頻率兩組相比亦無(wú)顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)(見(jiàn)表2)。

M：100 bp Maker，1-5泳道是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1、2雜合子GC型；3純合子CC型；4、5、6、7純合子GG型

3 討 論

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是巨噬細(xì)胞自分泌的一種重要的前炎癥因子。巨噬細(xì)胞不僅是產(chǎn)生MIF的主要細(xì)胞，也是MIF作用的靶細(xì)胞。MIF可能廣泛參與了機(jī)體多種生理及病理生理學(xué)反應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、脂肪發(fā)生、腎臟病變、腫瘤生成和皮膚創(chuàng)傷修復(fù)等。國(guó)內(nèi)李敬[3]、劉運(yùn)涌[4]發(fā)現(xiàn)MIF水平與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)，李歸宿[5]發(fā)現(xiàn)腦梗死患者M(jìn)IF水平減低，且MIF水平高低與 動(dòng)脈粥樣硬化患者病情輕重、梗死灶體積大小密切相關(guān)。另有作者[6～8]發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病、血管性癡呆、腔隙性腦梗死患者基線期、隨訪期患者中MIF水平均高于正常對(duì)照，認(rèn)為其可以作為老年癡呆早期診斷和認(rèn)知損傷程度判斷的敏感指標(biāo)。

表2 CI組與對(duì)照組MIF-173G/C基因型頻率和等位基因頻率比較

注：CI=腦梗死組，括號(hào)內(nèi)表示各亞組例數(shù)在總?cè)藬?shù)中的比例。與對(duì)照組相比，P>0.05

多種研究證實(shí)MIF基因-173G/C多態(tài)性與阻塞性呼吸睡眠暫停[9]、膀胱癌[10]、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[11]等多種疾病相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無(wú)顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)，兩種等位基因頻率兩組相比亦無(wú)顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)。下一步我們將對(duì)MIF-173G/C多態(tài)性與血糖、血脂代謝展開深入研究。目前對(duì)MIF-173G/C多態(tài)性研究結(jié)果不盡一致。Tereshchenko等[12]對(duì)捷克和俄羅斯的 459位心肌梗死患者，311位健康對(duì)照組進(jìn)行了基因分型，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組分布沒(méi)有顯著差別，但女性心肌梗死患者的GG基因型明顯高于女性對(duì)照組，與冠心病存在相關(guān)性(P=0.027)。Herde[13]一項(xiàng)對(duì)德國(guó)人長(zhǎng)達(dá)18 y的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)MIF-173G/C多態(tài)性和血清MIF 蛋白水平及2型糖尿病的發(fā)生無(wú)顯著相關(guān)性。我們認(rèn)為不同研究結(jié)果的差異可能與試驗(yàn)人群的差異包括飲食、環(huán)境和方法學(xué)的因素有關(guān)，當(dāng)然與抽樣誤差、樣本量大小等也有關(guān)聯(lián)。

本研究首次報(bào)道MIF-173G/C基因多態(tài)性分布及其與腦梗死的關(guān)系，通過(guò)研究我們未見(jiàn)MIF-173G/C基因多態(tài)性與腦梗死有關(guān)，G/C等位基因不是腦梗死發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

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Relationship between MIF-173G/C single nucleotide polymorphism and atherosclerotic cerebral infarction.

YUANNing，XUHongwei，LIUXuejun.

(XiangyaHospital，CentralSouthUniversity，Changsha410008，China)

Objective To study the relationship between MIF -173G/C single nucleotide polymorphism(SNPS) and atherosclerotic cerebral infarction(CI). Methods The genotypes for the tested MIF SNPs were detected by polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and DNA sequence. Results There existed -173G/C polymorphism of MIF in CI patients and controls，however，no significant differences were observed in genotypes and allele frequencies between CI patients and controls for MIF-173G/C polymorphism(P>0.05). Conclusion MIF-173G/C polymorphism has no significant correlation with CI patients and allele G/C isn’t an independent risk factor for CI.

Cerebral infarction； Macrophage migration inhibitory factor； Gene； Polymorphism

2016-11-20；

2017-02-13

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.湖南省腦科醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

劉學(xué)軍，E-mail：707151907@qq.com

1003-2754(2017)03-0247-03

R743

A