佟維娜 蔡 丹 鄭明珠 修 琳張 浩 陳方奇 劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長(zhǎng)春 130118）

（小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室2，長(zhǎng)春 130118）

羊肚菌固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白粉的研究

佟維娜1，2蔡 丹1，2鄭明珠1，2修 琳1，2張 浩1，2陳方奇1，2劉景圣1，2

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長(zhǎng)春 130118）

（小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室2，長(zhǎng)春 130118）

以玉米蛋白粉為主要原料，采用羊肚菌對(duì)其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，確定羊肚菌固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白粉的培養(yǎng)基配方以及培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：羊肚菌固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白粉最適培養(yǎng)基配方為玉米蛋白粉30 g、葡萄糖2.5%、MgSO4·7H2O 0.15%、KH2PO40.25%、含水量65%；最佳培養(yǎng)條件為接種量14%、培養(yǎng)溫度25℃、初始pH 6、發(fā)酵時(shí)間20 d。此條件下，得蛋白轉(zhuǎn)化率為22.36%，菌絲體生物量為0.136 9 g／g。對(duì)發(fā)酵前后玉米蛋白粉進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果表明：發(fā)酵后親水性氨基酸含量比發(fā)酵前提高12.75%。對(duì)玉米蛋白粉原料和發(fā)酵后玉米蛋白粉進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)酵后的玉米蛋白緊密的結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，表面積增加，表面凹凸加劇，孔洞更為明顯。

玉米蛋白粉 羊肚菌 固態(tài)發(fā)酵 菌絲體生物量 蛋白轉(zhuǎn)化率

玉米蛋白粉是玉米淀粉加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物。玉米醇溶蛋白是玉米的主要貯藏蛋白，占玉米蛋白總量的50%～60%?；谌芙庑院托蛄型葱裕梢苑譃?類(lèi)：α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、γ玉米醇溶蛋白和δ-玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白含有豐富的谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，從而具有良好的抗氧化性、成膜性和保水性，以及可塑性和穩(wěn)定性。但由于玉米醇溶蛋白中含有高比例的疏水性氨基酸，其獨(dú)特的氨基酸組成導(dǎo)致玉米蛋白的水溶性差，利用價(jià)值低和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較低，不能直接用于人類(lèi)消費(fèi)［1-2］。為了提高其利用率，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者在尋找玉米醇溶蛋白改性方法方面作了大量工作，包括物理改性［3-5］、化學(xué)改性［6-8］、生物改性［9-10］。在化學(xué)改性的生產(chǎn)中比較容易造成二次污染，需消耗大量的化學(xué)試劑，并且會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。而物理改性存在生物轉(zhuǎn)化率低等弊端。

本試驗(yàn)應(yīng)用微生物固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白粉，由于微生物發(fā)酵過(guò)程中分泌的復(fù)合酶對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的降解，使大分子蛋白部分降解為小分子蛋白或多肽以及氨基酸等。并且固態(tài)發(fā)酵投資少、能耗較少，不易產(chǎn)生廢氣，對(duì)環(huán)境污染少。我國(guó)羊肚菌資源豐富，其具有營(yíng)養(yǎng)、藥用價(jià)值高等特點(diǎn)［11-12］，且羊肚菌具有豐富的纖維素酶和木質(zhì)素酶，在發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生豐富的酶系，能夠更好的作用于玉米蛋白粉，降解玉米蛋白粉中的多糖、蛋白質(zhì)等，在進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白粉的同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生真菌毒素。目前羊肚菌固態(tài)發(fā)酵主要用于廚房垃圾制備飼料、豆渣等［13-14］。

本試驗(yàn)以玉米蛋白粉為主要原料，采用羊肚菌對(duì)其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，篩選最適的培養(yǎng)基配方，并探索最適培養(yǎng)條件，研究了在發(fā)酵過(guò)程中，菌絲體生物量、蛋白轉(zhuǎn)化率以及發(fā)酵前后玉米蛋白粉氨基酸模式以及微觀結(jié)構(gòu)的變化。為改善玉米醇溶蛋白功能特性，提高玉米蛋白粉的應(yīng)用領(lǐng)域提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

羊肚菌菌種Me-01（Morchella esculenta）：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 菌種保存斜面培養(yǎng)基

固體麥芽汁培養(yǎng)基：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 試劑

玉米蛋白粉：吉林中糧生化能源銷(xiāo)售有限公司；玉米粉、馬鈴薯：市售；可溶性淀粉：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；麥芽糖、酵母浸粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LD5-2B離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；K1100全自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；日立L-8900高速氨基酸分析儀：日立高新技術(shù)公司；NL-642HT PHENOM臺(tái)式掃描電鏡：復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司；FLUO Omega多功能微孔板測(cè)讀儀：德國(guó)BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌的活化

將4℃保藏的羊肚菌菌種轉(zhuǎn)接至新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱27℃培養(yǎng)至第12天時(shí)采用。

1.3.2 發(fā)酵種子液的制備

葡萄糖2%，酵母浸粉1%，MgSO4·7H2O 0.075%，KH2PO40.12%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，pH

值自然，121℃滅菌20 min，在無(wú)菌環(huán)境中，從活化好的斜面培養(yǎng)基中取3塊菌體接入到裝有30 mL液體種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于27℃恒溫進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，160 r／min培養(yǎng)6 d得制得發(fā)酵種子液。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

分別以玉米蛋白粉（15、20、25、30、35、40 g），葡萄糖（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%），KH2PO4（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），MgSO4·7H2O（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），含水量（50%、55%、60%、65%、70%、75%）為單因素，固定值分別為玉米蛋白粉20 g、葡萄糖2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、含水量65%?？疾爝@5個(gè)因素對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量的影響，并選用L16（45）正交表（表1）確定最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

表1 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)因素和水平

1.3.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以培養(yǎng)溫度（19、22、25、28、31℃），接種量（10%、12%、14%、16%、18%），初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），發(fā)酵時(shí)間（16、18、20、22、24 d）為單因素，固定值分別為培養(yǎng)溫度25℃、接種量12%、pH 6、培養(yǎng)時(shí)間20 d，考察這4個(gè)因素對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量的影響，并選用正交表L9（34）（表2），確定最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件。

表2 培養(yǎng)基條件正交試驗(yàn)因素和水平

1.3.5 發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體生物量的測(cè)定

1.3.5.1 純菌絲體的獲得

液體擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液用6層尼龍布過(guò)濾，將尼龍布上的濾出物用蒸餾水充分洗滌，收集濾出物，烘箱60℃烘至恒重，將烘干后的菌絲體用研缽研碎，置于干燥器中備用。

1.3.5.2 核酸的提取以及測(cè)定方法

純菌體中核酸的提取和測(cè)定：參照魏培蓮等［15］在3種固態(tài)發(fā)酵生物量測(cè)定方法的比較中的方法進(jìn)行測(cè)定。稱取0.1 g純菌體，加入25 mL 5%的三氯乙酸溶液，在80℃水浴中提取25 min，并不斷攪拌，取出后冰浴，在8 000 r／min 4℃條件下離心15 min，取上清液稀釋5倍，以5%三氯乙酸作空白對(duì)照，于260 nm處測(cè)OD值。

羊肚菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中核酸的提取和測(cè)定：取0.25 g干燥培養(yǎng)物，研磨后按純菌體中核酸的提取方法進(jìn)行提取，未經(jīng)發(fā)酵的固態(tài)基質(zhì)采用同樣的方法處理作為空白對(duì)照，在260 nm處測(cè)OD值，所測(cè)OD值對(duì)照純菌體與核酸紫外吸收曲線關(guān)系（如圖1）換算成菌體量。

發(fā)酵產(chǎn)物的菌絲體生物量＝被利用的發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體生物量-未經(jīng)發(fā)酵的固態(tài)基質(zhì)中菌絲體生物量

1.3.5.3 純菌體中核酸含量與菌體量的線性關(guān)系

羊肚菌菌體與核酸紫外吸收曲線關(guān)系，如圖1所示，純菌體與核酸紫外吸收曲線關(guān)系回歸方程為：y＝3.777 7x+0.013 6，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 2；式中：y為260 nm波長(zhǎng)處的吸光值；x為每克干基質(zhì)中菌絲體的生物量。

1.3.6 蛋白轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

總蛋白的測(cè)定：參照GB 5009.5—2010凱氏定氮法測(cè)定?？扇苄缘鞍椎臏y(cè)定：稱取樣品0.5 g，加8 mL水研磨，4 000 r／min離心10 min，上清液定容至10 mL，再應(yīng)用GB 5009.5—2010凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量。

圖1 純菌體中核酸量與菌絲體質(zhì)量的關(guān)系

蛋白轉(zhuǎn)化率按照公式進(jìn)行計(jì)算［16-17］：

蛋白轉(zhuǎn)化率／%＝（可溶性蛋白的含量÷原發(fā)酵培養(yǎng)基中的總蛋白含量）×100%

1.3.7 發(fā)酵前后氨基酸成分以及含量對(duì)比

利用L-8900高速氨基酸分析儀對(duì)玉米蛋白粉及最優(yōu)條件下發(fā)酵產(chǎn)物的組分進(jìn)行氨基酸組成以及含量的測(cè)定。

1.3.8 掃描電鏡樣品處理

將發(fā)酵前后的玉米蛋白粉進(jìn)行烘干，分別均勻固定在電鏡進(jìn)樣臺(tái)上，真空條件下進(jìn)行噴金，然后固定在載物臺(tái)上，在1 000倍和4 000倍下尋找有代表性的圖片進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基配方的單因素試驗(yàn)

2.1.1 最適氮源和碳源添加量的確定

如圖2所示，當(dāng)玉米蛋白粉添加量為20 g時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量最高，分別為17.32%，

0.093 4 g／g；當(dāng)葡萄糖添加量為2.0%時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量最高，分別為17.32%、0.093 4 g／g。

圖2 最適氮源和碳源添加量的確定

2.1.2 最適MgSO4·7H2O和KH2PO4添加量的確定

如圖3所示，當(dāng)MgSO4·7H2O為0.2%時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量最高，分別為17.43%、0.093 4 g／g；當(dāng)KH2PO4為0.15%時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量最高，分別為17.52%、0.102 3 g／g。

圖3 MgSO4·7H2O和KH2PO4添加量的確定

2.1.3 最適含水量的確定

如圖4所示，當(dāng)含水量為65%時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量最高，分別為17.43%、0.093 4 g／g。

圖4 最適含水量的確定

2.2 培養(yǎng)基配方的正交優(yōu)化試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。從正交試驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)以菌絲體生物量為指標(biāo)時(shí)，影響菌絲體生物量的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞E＞D，最優(yōu)培養(yǎng)基配方A3B2C3D1E4不在這16組中，所以進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得蛋白轉(zhuǎn)化率為21.12%，菌絲體生物量為0.131 2 g／g。當(dāng)以蛋白轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)時(shí)，影響蛋白轉(zhuǎn)化率的主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D＞E，最優(yōu)培養(yǎng)基配方A3B3C3D2E4不在這16組中，所以進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得蛋白轉(zhuǎn)化率為21.92%，菌絲體生物量為0.132 3 g／g。

表3 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果

由于以菌絲體生物量為指標(biāo)和以蛋白轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)得出的最終結(jié)果不一致，通過(guò)數(shù)據(jù)分析得知以蛋白轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)得到的蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量比以菌絲體生物量為指標(biāo)得出的高0.8%、0.001 1 g／g。故選取以蛋白轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)所確定的培養(yǎng)基配方A3B3C3D2E4，即含水量65%，玉米蛋白粉30 g，葡萄糖2.5%，MgSO4·7H2O 0.15%，KH2PO40.25%。

2.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

2.3.1 培養(yǎng)溫度和接種量的確定

如圖5所示，當(dāng)溫度為25℃時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量最高，分別為21.92%、0.132 3 g／g；當(dāng)接種量為14%時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量最高，分別為22.36%、0.136 9 g／g。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)時(shí)間的確定

如圖6所示，當(dāng)初始pH為6時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物量最高，分別為21.92%、0.132 3 g／g；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為20 d時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率、菌絲體生物最高，分別為21.92%、0.132 3 g／g。

2.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。由正交試驗(yàn)結(jié)果得，以菌絲體生物量為指標(biāo)，影響菌絲體生物量的主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，最佳培養(yǎng)條件A2B2C2D2，蛋白轉(zhuǎn)化率為22.36%，菌絲體生物量為0.136 9 g／g。當(dāng)以蛋白轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)時(shí)，影響菌絲體生物量的主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，最佳培養(yǎng)條件A2B3C1D2，蛋白轉(zhuǎn)化率為18.92%，菌絲體生物量為0.125 7 g／g。

圖5 培養(yǎng)溫度和接種量的確定

圖6 最適pH和培養(yǎng)時(shí)間的確定

表4 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

由于以菌絲體生物量為指標(biāo)和以蛋白轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)得出的最終結(jié)果不一致，數(shù)據(jù)分析得知以菌絲體生物量為指標(biāo)得到的菌絲體生物量、蛋白轉(zhuǎn)化率比以蛋白轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)得出的高0.011 2 g／g、3.34%。故選取以菌絲體生物量為指標(biāo)所確定的培養(yǎng)條件A2B2C2D2，即接種量14%，培養(yǎng)溫度25℃，初始pH 6，發(fā)酵時(shí)間20 d。

2.5 玉米蛋白粉與發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸分析

將玉米蛋白粉與最優(yōu)培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸進(jìn)行對(duì)比，如表5所示。

表5 發(fā)酵前后玉米蛋白粉的氨基酸分析對(duì)比

從圖7可以看出，發(fā)酵前后玉米蛋白粉氨基酸構(gòu)成基本上保持一致，但發(fā)酵后親水性氨基酸所占百分比發(fā)酵前提高了12.75%，該現(xiàn)象表明，羊肚菌固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白粉不但在一定程度上保留了玉米蛋白的原有氨基酸的模式，而且使得親水性氨基酸含量增高，更有利于應(yīng)用。

圖7 發(fā)酵前后親水性氨基酸和疏水性氨基酸對(duì)比

2.6 掃描電鏡結(jié)果分析

由圖8可見(jiàn)，玉米蛋白粉在發(fā)酵前后的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了變化。玉米蛋白粉微觀結(jié)構(gòu)的大小及形狀無(wú)規(guī)則性，表面凹凸不平，呈現(xiàn)極為緊密的狀態(tài)。與玉米蛋白粉相比可看出，發(fā)酵后的玉米蛋白粉表面積增加且表面凹凸加劇，孔洞的結(jié)構(gòu)更為明顯。此現(xiàn)象表明，在發(fā)酵過(guò)程中，羊肚菌代謝產(chǎn)生蛋白酶，玉米蛋白粉底物與酶的充分接觸，在酶解情況下，打開(kāi)了玉米蛋白粉緊密的結(jié)構(gòu)，促使水溶性增加。

圖8 發(fā)酵前后玉米蛋白粉掃描電鏡圖片（×4 000）

3 結(jié)論

綜合羊肚菌固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白粉培養(yǎng)基配方優(yōu)化和培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果，可以得出，玉米蛋白粉30 g、含水量65%、葡萄糖2.5%、MgSO4·7H2O 0.15%、KH2PO40.25%、接種量14%、培養(yǎng)溫度25℃、初始pH 6、發(fā)酵時(shí)間20 d。在此條件下蛋白轉(zhuǎn)化率為22.36%，菌絲體生物量為0.136 9 g／g。測(cè)得發(fā)酵后親水性氨基酸所占百分含量比發(fā)酵前提高了12.75%，同時(shí)通過(guò)掃描電鏡觀察得出，發(fā)酵后的玉米蛋白緊密的結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，表面凹凸加劇，表面積增加，孔洞更為明顯。

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Solid Fermentation for Zein by Morchella Esculenta

Tong Weina1，2Cai Dan1，2Zheng Mingzhu1，2Xiu Lin1，2Zhang Hao1，2Chen Fangqi1，2Liu Jingsheng1，2

（College of food science and Engineering，Jilin Agricultural University1，Changchun 130118）
（National Engineering Laboratory for Wheat&Corn Further Processing2，Changchun 130118）

This experiment determined the medium formulation and cultural condition of solid-state fermentation of zein using morchella esculenta with corn protein powders as the main materials，in which morchella esculenta was implemented with solid fermental cultivation.The results showed that the optimum medium formulation was：30 g corn protein powders，21%glucose，0.15%MgSO4·7H2O，0.15%KH2PO4，65%H2O；the optimum cultural condition was：14%Morchella inoculum size，cultural temperature 25℃，initial pH 6，fermentation for 20 d.The ratio of protein transformation and mycelium biomass were 22.36%，0.136 9 g／g under the above conditions，respectively.The amino acid analysis of corn protein powders before and after fermentation showed that the content of hydrophilic amino acids was increased by 12.75%compared to corn protein powders before fermentation.The scanning election microscope analysis of corn protein powders before and after fermentation showed that the tight structure of proteins was opened，surface areas were increased，convexo-concave degree was grown on，and holes were more apparent after fermentation.

zein，Morchella esculenta，solid fermentation，mycelium biomass，protein conversion rate

TS210

A

1003-0174（2017）01-0113-06

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃（20140204011NY），國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS02-29）

2015-06-15

佟維娜，女，1987年出生，碩士，發(fā)酵微生物的選育與代謝調(diào)控

劉景圣，男，1964年出生，教授，糧食深加工與功能性食品