應 奇，魯守龍，張風林，徐小龍，唐 瑛，焦 勇，王 銓，王曉熙，張曉莉，魯 寧

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·基礎醫(yī)學· ·論著·

重型顱腦損傷的動物實驗模型制作及其臨床意義

應 奇，魯守龍，張風林，徐小龍，唐 瑛，焦 勇，王 銓，王曉熙，張曉莉，魯 寧

目的 探索可復制重度顱腦損傷實驗大鼠動物模型的制作。方法 采用改良自由落體裝置，撞擊80例麻醉后實驗鼠顱骨穹窿部，砝碼質量50～200 g，高度20～50 cm，撞擊后觀察時間為4 h～12 d，麻醉后取腦，制作652張病理切片，觀察腦病理切片與臨床腦創(chuàng)傷的相關性。結果 確認最佳沖擊力為10 000 g/cm，病理改變與臨床有顯著相關性，對重型創(chuàng)傷性顱腦損傷的診治有參考價值。運用模擬臨床的閉合性減壓術與開放性減壓術對比，獲得有益提示，后者更有利于腦創(chuàng)傷康復。結論 通過本實驗找到創(chuàng)傷性重型顱腦損傷大鼠最佳致傷沖擊力，實驗動物與臨床有顯著相關性，開放減壓比閉合減壓更有利于腦康復。

重型顱腦損傷；致傷沖擊力；臨床意義；開放性減壓

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury, TBI)，特別是重型顱腦損傷(severe trauma brain injury，S-TBI)是醫(yī)學界面臨的難題和研究熱點之一[1]。為了進一步提高重型顱腦損傷的救治水平，作者探索復制重型顱腦損傷模型。目前TBI動物實驗模型方法很多，但達到類似於人類重型顱腦損傷的動物實驗鮮有報道[2]。作者通過系列動物實驗，找到最佳致傷沖擊力達到重型顱腦損傷實驗動物模型的方法，并且通過致傷后各時間點觀察，病理學取材進行大批量病理切片閱讀、觀察，發(fā)現(xiàn)許多病理變化與臨床腦創(chuàng)傷表現(xiàn)的相關性。這些發(fā)現(xiàn)，對提高臨床診斷治療水平，改進治療方法，有一定的參考價值[3]。

本研究還進行了閉合性減壓和開放性減壓在實驗動物模型中的表現(xiàn)及病理變化比較，從中獲得一些有益的提示。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。80只SD/SPF級大白鼠，雄性，體質量225～337 g，按沖擊力大小隨機分組。

1.2 方法

1.2.1 創(chuàng)傷裝置 本研究采用改良的傳統(tǒng)自由落體腦損傷方法，創(chuàng)傷裝置由支架、砝碼、導引管、底座等組成(圖1)。

圖1 改良大鼠腦創(chuàng)傷裝置

1.2.2 大鼠閉合性腦損傷模型的制作 實驗鼠予以10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔麻醉。消毒頭皮后沿中線縱向切開頭皮約3 cm，顯露雙側顱骨穹窿部，在麻醉狀態(tài)下，分別用不同50、100、250、500 g砝碼在20、30、37、40、50 cm不同高度，實施自由落體撞傷顱骨顯露區(qū)。撞擊后即刻縫合頭皮，置入飼養(yǎng)籠內留觀，常規(guī)飼養(yǎng)。

實驗動物腦損傷的致傷沖擊力，由撞擊物重量乘以撞擊物始發(fā)點高度的乘積，單位為(g/cm)[4]。致傷沖擊力分別為1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、4 000、5 000、9 250、10 000、12 500、18 500、24 700、0 g/cm，相應實驗動物數(shù)分別為14、2、2、5、3、3、4、2、33、4、2、3、3 只。

在沖擊力1 000 g/cm組隨機選6只大鼠和在10 000 g/cm組隨機選6只大鼠，按等比行閉合性減壓和開放減壓手術，閉合性手術即受沖擊后磨鉆去除雙側顱骨穹窿部，直線切開雙側硬腦膜，頭皮縫合，開放減壓手術則去除顱骨穹窿部，直線切開雙側硬腦膜，敞開創(chuàng)面，用無菌生理鹽水紗布覆蓋。

將各組大鼠于傷后4、6、24、72、168、288 h，腹腔麻醉后取腦(10%水合氯醛0.35 g/kg)，置入10%甲醛液中固定24 h以上。

1.2.3 取材及病理切片觀察 在大腦正中線外側1～2 mm處作矢狀切面包含大腦、小腦、腦干3部分，取材厚度約5 mm，石蠟包埋，切片厚度1 μm連續(xù)切片，HE染色，在病理切片閱讀時，按照頂、額葉—顱底—腦室、導水管，圖片拍攝取鏡發(fā)現(xiàn)病變后依次按低、中、高倍攝片(低∶10×4、中∶10×10、高∶10×40倍)。

2 結果

2.1 實驗鼠的大體觀察

實驗鼠在麻醉狀況下，受到重物撞擊后的反應與沖擊力有明顯差異[5]。當沖擊力在1 000 g/cm時，左或右下肢僅抽搐1 s左右；沖擊力在3 000 g/cm時，受撞擊大鼠心跳、呼吸明顯加快；沖擊力在4 000 g/cm時，實驗大鼠全身突發(fā)抽搐1～2 s，呼吸、心跳加速，下肢(左或右)抽搐約3 s；沖擊力5 000 g/cm時，沖擊用砝碼表面見血跡，大鼠突發(fā)抽搐幅度加大，沖擊力達10 000 g/cm，實驗大鼠全身大幅度抽跳2 s，1只大鼠伴背部躬起，當沖擊力超過10 000 g/cm，大鼠均口鼻出血，隨即死亡。

在沖擊力10 000 g/cm實驗大鼠7 d后取腦時，可見大鼠硬腦膜外及硬腦膜下均有陳舊性血腫。顱骨有松脆感，并可見腦組織碎裂。

經頭部撞擊后存活大鼠麻醉后蘇醒時間、活動頻度、食欲等與所受沖擊力有關聯(lián)[6]。麻醉蘇醒通常為1 h后。1例大鼠有定位體征，如向右旋轉、爬動。有一例(沖擊力10 000 g/cm)大鼠蘇醒后，精神萎靡，不進食水。眼臉下垂，2 d后死亡。

開放性減壓比閉合性減壓后實驗鼠活動頻度要高。頭頂部開放創(chuàng)口，4 d后自行愈合。

2.2 實驗鼠腦病理切片的觀察

共制作652張實驗鼠腦病理切片的圖片。正常無損傷實驗大鼠大腦皮質圖，蛛網膜清晰，連續(xù)性好，蛛網膜下腔顯示清楚，皮層(Ⅰ-Ⅳ)分子層、顆粒層、錐體細胞層及膠質細胞分布均勻(圖2A)。四腦室及脈絡叢形態(tài)規(guī)整(圖2B)。

大鼠頭部受損傷后全腦彌漫性受損，致傷局部較重，表現(xiàn)為傷處腦水腫明顯，神經細胞腫脹，核偏位變性壞死(圖3A)，錐體細胞受損后發(fā)生嗜神經現(xiàn)象(圖3B)，腦實質區(qū)出血，局部血腫形成(圖3C)，腦組織疏松，呈海綿狀，大量空泡化，神經纖維走行紊亂、斷裂、扭曲變形(圖3D)，外傷性蛛網膜下腔出血(圖3E)，腦外傷腦室明顯擴大(圖3F)。

圖2 正常無損傷實驗大鼠大腦皮質圖

圖3 致傷后大鼠腦部病理切片

閉合性減壓大鼠，大腦皮層區(qū)水腫面積大(圖4A)，空泡變性明顯(圖4B)，開放性減壓大鼠大腦皮層區(qū)水腫范圍表淺，面積小(圖4C)，空泡變性存在，程度輕(圖4D)。

圖4 致傷后分別行閉合性減壓和開放性減壓大鼠腦部病理切片

3 討論

筆者采取自由落體撞擊模擬人類頭部創(chuàng)傷，由于大鼠頭皮較松弛、易滑動，故采取麻醉后切開頭部中線3 cm，可達到直接致傷效果，避免頭皮滑動，受力不確切造成的誤差。砝碼頂端設一牽引線，可避免2次撞擊。本實驗方法受力效果與加速性腦損傷效果類似，可控性好，可復制，方法簡單易行[7]。

本顱腦損傷動物實驗分3個階段實施，撞擊重量及高度逐步調整，從實驗效果可得出以致傷沖擊力10 000 g/cm是臨界點，超過這一沖擊力可使實驗大鼠立即死亡，死亡原因是大鼠頭部受力過度，發(fā)生口鼻出血，氣道阻塞，窒息；另外，腦組織超過耐受極限，引起下丘腦等神經功能瞬間紊亂也是發(fā)生死亡的重要因素。啟示：大鼠頭部創(chuàng)傷達到致傷沖擊力10 000 g/cm時，不僅受擊處局部發(fā)生腦創(chuàng)傷反應，而且大腦深部包括小腦、腦干區(qū)都有挫傷反應。因此，在臨床上，必須把(S-TBI)當成全腦損傷，這可以解釋為什么有時血腫清除后，患者仍然昏迷，病情依然加重。

腦外傷后，錐體細胞受損發(fā)生嗜神經現(xiàn)象，伴變性、壞死是臨床患者產生定位體征的重要原因。彌漫性軸索損傷是一種較為嚴重的腦損傷，大量神經纖維發(fā)生斷裂、水腫、扭曲、變性，脫髓鞘是造成患者長期昏迷、頑固性腦水腫的原因之一[9]。

外傷性蛛網膜下腔出血，可致患者傷后顱內壓增高、頭痛等。蛛網膜出血幾天內，60%～70%患者會出現(xiàn)腦血管痙攣，并有一半患者伴隨腦缺血，因此，傷后早期在顱內壓監(jiān)控情況下腦室引流或腰大池引流，可有預防性作用[8]。顱腦外傷后，腦室可以擴大也可能縮小，擴大系腦室內出血，腦脊液通道受阻引起，縮小則可能是腦水腫，腦腫脹擠壓側腦室造成[10]。

比較閉合性減壓和開放性減壓，從病理切片上可以看出受傷處腦皮層水腫的差異，前者水腫范圍大，侵及范圍深；后者腦水腫范圍小，侵及范圍淺，空泡變性后者亦輕于前者，這是因為開放減壓后，腦損傷產生的高顱壓向外釋放，血性腦脊液向外溢出，顱內壓隨之也降低，這樣就有利于實驗鼠度過腦創(chuàng)傷后腦水腫，腦腫脹危險期，便于腦創(chuàng)傷的康復。

創(chuàng)傷后最突出的反應是顱內壓增高，目前，臨床上常用的標準去大骨瓣減壓等有一定效果，但是還不夠充分、徹底，特別對那些嚴重的TBI，開放性減壓法提供了一條重要、有效途徑，上述病理觀察是一個佐證。

4 展望

TBI動物模型可用于腦損傷的系列研究。由于S-TBI死亡率、傷殘率極高，因此，它應該成為今后重點研究方向[11]。創(chuàng)建S-TBI實驗動物模型和選用大動物(兔、貓、狗等)做進一步的動物實驗可能與人類創(chuàng)傷反應的相似度更高些。本模型制作方法有助于改變傳統(tǒng)治療模式和思路，探索新的有效治療方法和手段。

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(本文編輯：林永麗)

Development of laboratory animal model of serious traumatic brain injury and its clinical significance

YingQi,LuShoulong,ZhangFenglin,XuXiaolong,TangYin,JiaoYong,WangQuan,WangXiaoxi,ZhangXiaoli,LuNing

(DepartmentofNeurosurgery,No.411Hospital,CPLA,Shanghai200081,China)

Objective To establish replicable animal model of serious traumatic brain injury (S-TBI) in rats.Methods An improved free fall apparatus was used to give impacts on the vault of skull of 80 anesthetized rats with a 50-200 g weight from a 20-50 cm height, the rats were observed for 4 hr to 12 days after impact, and brain was collected after anesthesia to make 652 pathological sections.Results The optimum impact force was determined as 10 000 g/cm. There was a marked correlation between pathological changes and clinical manifestation, which had a reference value to the diagnosis and treatment of S-TBI. A comparison between simulated clinical closed decompression and open decompression indicated that the latter was more favorable for the rehabilitation of brain trauma.Conclusion The optimum impact force was found in rats of severe traumatic brain injury through experiments; experimental animals were significantly correlative to clinical diagnosis and treatment; open decompression was more beneficial to brain rehabilitation.

Severe traumatic brain injury; Trauma-inducing impact; Clinical significance; Open decompression; Close decompression

200081 上海，解放軍第四一一醫(yī)院(應奇、魯守龍、張風林、徐小龍)，病理科(王曉熙、張曉莉)；海軍醫(yī)學研究所實驗動物中心(唐瑛、焦勇、王銓)；中石化上海研究院信息中心(魯寧)

魯守龍，電子信箱：lushoulong@163.com

R651.15

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.02.008

2016-03-17)