李彩霞，張淑坤，李志剛，司傳領

實驗研究

核桃青皮粗提物誘導KYSE150食管癌細胞周期阻滯及凋亡

李彩霞1，張淑坤1，李志剛2，司傳領3

目的：研究核桃青皮粗提物誘導KYSE150人食管癌細胞周期阻滯和凋亡的作用機制。方法：MTT方法檢測核桃青皮粗提物對KYSE150細胞增殖的抑制效果，流式細胞儀檢測核桃青皮粗提物對KYSE150細胞周期和細胞凋亡的影響，Western blot檢測核桃青皮粗提物引起的細胞周期相關蛋白和凋亡相關蛋白的變化。結果：MTT結果顯示，核桃青皮粗提物對KYSE150細胞的增殖抑制呈時間和濃度依賴性，當核桃青皮粗提物濃度為100 μg/mL時，在24 h，48 h和72 h對KYSE150細胞的增殖抑制率分別為(43.69±1.02)%，(88.73±1.32)%和(93.06±2.34)%；流式細胞術結果表明，核桃青皮粗提物誘導KYSE150細胞周期阻滯和凋亡；Western blot結果表明，核桃青皮粗提物通過上調(diào)p53，phospho-p53(p-p53)蛋白的表達，下調(diào)cyclinD1蛋白的表達，誘導KYSE150細胞周期阻滯在G0/G1期。另一方面，核桃青皮粗提物通過上調(diào)Bax蛋白,下調(diào)Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達，從而誘導細胞凋亡。當核桃青皮粗提物濃度為40 μg/mL時，可上調(diào)p53，p-p53，Bax的表達量分別為對照組的（1.8±0.07），（23.6±0.12）和（1.5±0.02）倍，下調(diào)cyclinD1，Bcl-2和Caspase-3的表達量分別為對照組的（0.3±0.02），（0.03±0.005）和（0.1±0.01）倍。結論：核桃青皮粗提物可以引發(fā)KYSE150細胞周期阻滯在G0/G1期，并且可以通過線粒體途徑誘導KYSE150細胞凋亡。

核桃青皮粗提物；KYSE150細胞；增殖；周期；凋亡

食管癌在各類腫瘤的發(fā)病率中排名第八，其死亡率在癌癥總死亡率中占第四位[1]。近年來，由于化學藥物毒副作用較大，限制了在臨床上的廣泛應用，所以從植物中尋找更安全的抗癌有效成分越來越受人們重視。核桃青皮又稱青龍衣，為核桃外部厚厚的一層未成熟的果皮。白桃湯劑為民間抗癌藥方，而核桃青皮就是此湯劑的主要成分之一[2]。核桃青皮很久以前就已經(jīng)被用于治療不同的疾病，如胃癌、肺癌[3-5]。研究已經(jīng)證明，核桃青皮的提取物具有很強的抗菌和抗氧化活性[6-7]。我們先前的研究表明，核桃青皮提取物中的粗提取，乙酸乙酯提取物和沒食子酸對食管癌KYSE150和EC9706細胞的增殖均有抑制作用，并初步探討了其可能的作用機制[8]。本研究在之前的基礎上，集中探討核桃青皮粗提物對食管癌細胞KYSE150的增殖抑制作用，以及其對KYSE150細胞周期和凋亡的影響，并且進一步探討其對細胞周期相關蛋白和凋亡相關蛋白的變化，從而為進一步開發(fā)治療食管癌的中藥提取物提供更多的理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞 食管癌細胞株KYSE150（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺癌研究所提供）。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)細胞，每1～2 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞。

1.2 藥物 核桃青皮用95%的乙醇萃取4次，風干得到微細粉末即為核桃青皮粗提物。

1.3 主要試劑 胎牛血清（Hyclone）、RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone）、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞楓（DMSO）、DNase free RNase（Thermo Fisher）、Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kits(北京四正柏生物公司，凋亡試劑盒批號：FXP018，周期試劑盒批號：FXP021)、RIPA細胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒（索萊寶）、一抗兔抗人Caspase 3、小鼠抗人p53和兔抗人p-p53(Santa Cruz),一抗兔抗人Bax,兔抗人Bcl-2，小鼠抗人cyclinD1和兔抗人GAPDH（Cell Signaling）抗體，HRP標記的羊抗兔Ig G二抗，HRP標記的羊抗小鼠Ig G二抗。

1.4 MTT檢測細胞增殖情況 將80 mg核桃青皮粗提物溶于1 mL的DMSO中，配成80 mg/mL儲存濃度，用時稀釋。取對數(shù)期生長的KYSE150，以每孔5000個細胞/100 μL密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度的核桃青皮粗提物的培養(yǎng)液100 μL，濃度分別為5、10、20、30、 40、50、60、80、100 μg/mL，另設對照孔(加培養(yǎng)液100 μL和與溶解藥物等量的DMSO)，每組設6個復孔。細胞分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加入DMSO 150 μL，輕輕振蕩后用酶標儀檢測，570 nm處測各孔吸光值(OD值)，計算抑制率，細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。重復3次。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期的變化 將KYSE150細胞接種于六孔板，密度為3×105/孔，使用不同濃度的核桃青皮粗提物（0、10、20、40 μg/mL）處理，培養(yǎng)24 h后,收集各組全部細胞到15 mL離心管中，預冷的PBS洗2次，然后加入1 mL預冷的70%乙醇4℃固定細胞過夜，再用PBS洗滌2次后收集細胞于流式管，加入預先配置好的含有RNase A和PI的染色液0.4 mL，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴30 min后，用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。重復3次。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞的凋亡率 KYSE150細胞分組及加藥情況同1.5，24 h后離心收集細胞。以PBS洗滌2次后加入250 μL結合緩沖液重新懸浮細胞于流式管中，再加入5 μL Annexin V/FITC混勻后加入10 μL 120 μg/mL的PI溶液，設置空白對照組和單色對照組。混勻后室溫避光孵育15 min，在反應管中加300 μL PBS，混勻后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。重復3次。

1.7 Western blot檢測細胞周期凋亡和細胞凋亡相關蛋白表達情況 分組及加藥情況同1.5，孵育24 h，提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白定量后，取35 μg蛋白與上樣緩沖液混勻，使用SDS-PAGE法對變性后的蛋白進行電泳，轉膜后室溫封閉2 h，一抗分別為p53（1∶100）、p-p53（1∶100）、cyclin D1（1∶1000）、Caspeas-3（1∶100）、Bax（1∶500）和Bcl-2（1∶500），4℃孵育過夜。使用TBST洗膜5次，二抗羊抗小鼠或羊抗兔（1∶5000）37℃孵育2 h。再用TBST洗膜5次后使用ECL進行顯色，隨后使用BIO-RAD膠成像儀曝光，檢測條帶灰度值（蛋白相對表達量=目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度×100%）。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0軟件分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析法進行組間比較，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 核桃青皮粗提物對KYSE150細胞增殖的抑制作用 隨著核桃青皮粗提物作用時間的延長，KYSE150細胞的增殖受到抑制，且抑制作用呈時間劑量依賴性（見圖1A）。對照組KYSE150細胞生長活躍，經(jīng)核桃青皮粗提物5～100 μg/mL處理48 h后，KYSE150細胞生長逐漸緩慢，增殖抑制率從（0.69± 2.27）%升高至（85.73±1.32）%。核桃青皮粗提物能有效的抑制KYSE150細胞的增殖，與對照組相比有統(tǒng)計學意義（見圖1B）。

圖1 核桃青皮粗提物對食管癌細胞KYSE150增殖的抑制作用

2.2 核桃青皮粗提物誘導KYSE150細胞周期阻滯在G0/G1期 核桃青皮粗提物對食管癌細胞株KYSE150作用24 h后，與對照組比較，不同濃度的核桃青皮粗提物均使細胞阻滯在G0/G1期的比例升高，同時S、G2/M期比例減少。并且核桃青皮粗提物的濃度越高，阻滯在G0/G1期的細胞比例就越高，（見表1）。

表1 核桃青皮粗提物對食管癌細胞株KYSE150細胞周期的影響（±s，%，n=3）

表1 核桃青皮粗提物對食管癌細胞株KYSE150細胞周期的影響（±s，%，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與10 μg/mL濃度組比較，bP＜0.01；與20 μg/mL濃度組比較，cP＜0.01

組別對照組核桃青皮粗提物組質(zhì)量濃度（μg/mL）0 10 20 40 G0/G1期S期G2/M期32.58±0.003 37.42±0.496a 40.48±0.832a、b 42.51±1.010a、b、c 47.10±0.014 46.87±1.184 45.29±1.137 41.49±1.138a、b、c 20.33±0.013 16.24±0.780a 14.22±1.320a 15.99±1.080a、b、c

圖2 不同濃度核桃青皮粗提物對KYSE150細胞凋亡的影響

2.3 核桃青皮粗提物誘導KYSE150細胞凋亡 不同濃度（10、20、40 μg/mL）的核桃青皮粗提物作用于KYSE150細胞24 h后，細胞早期凋亡率分別為（14.44±2.98）%、（21.07±2.64）%、（29.59±3.75）%，與對照組（8.56±0.44）%相比明顯升高（P＜0.05）。見圖2。 2.4 核桃青皮粗提物對KYSE150中細胞周期相關蛋白p53、p-p53、cyclinD1以及與凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2以及Caspase-3表達的影響 使用Western blot法檢測p53、p-p53以及G0/G1期周期蛋白cyclin D1的表達情況，發(fā)現(xiàn)不同濃度的核桃青皮粗提物作用于KYSE150細胞24h后，p53、p-p53蛋白的表達量隨著藥物濃度的增加而逐漸增加（P＜0.05，圖3A，3C），而cyclinD1蛋白的表達量隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱（P＜0.05，圖3A，3C）。同時，使用Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白Bax，Bcl-2以及Caspase-3的表達情況，發(fā)現(xiàn)Bax蛋白的表達情況隨著核桃青皮粗提物濃度的增加而逐漸增加（P＜0.05，圖3B，3D），而Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達情況隨著核桃青皮粗提物濃度的增加而逐漸減弱（P＜0.05，圖3B，3D）。

3 討論

核桃植株全身都是寶，除其果仁可食用外，核桃青皮、核桃殼、核桃葉等均可入藥，而且采集方便，具有消熱、解毒、抗癌、鎮(zhèn)痛等作用。核桃青果皮又稱青龍衣為核桃楸和核桃的未成熟外果皮。自《山東中草藥手冊》稱之為“青龍衣”后，現(xiàn)多延用此名稱。辛、苦、澀、平，有清熱解毒、祛風療癬、止痛止痢的功效，具有廣泛的藥用價值，特別是其抗癌活性，越來越受到重視。文姝等[9]以Western Blot方法檢測青龍衣提取液作用后的白血病K526細胞的p53、p21蛋白表達，結果p53、p21蛋白表達量均有增加，從而抑制周期蛋白依賴性激酶活性，使細胞停滯于G1期。徐巍等[10]研究表明青龍衣可顯著抑制人肝癌SMMC-7721細胞生長、繁殖，且與作用時間、劑量呈明顯相關性。但核桃青皮粗提物對食管癌的抗腫瘤作用未見報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮粗提物可有效的抑制食管癌細胞株KYSE150的細胞增殖，并且呈濃度和時間依賴性。本實驗旨在研究核桃青皮粗提物抑制KYSE150細胞增殖并且誘導其細胞凋亡的機制，為探究核桃青皮開發(fā)為抗食管癌藥物提供實驗基礎和依據(jù)。

圖3 核桃青皮粗提物對KYSE150細胞p53，p-p53，cyclinD1，Bax，Bcl-2以及Caspase-3蛋白表達的影響

我們研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮粗提物處理KYSE150細胞24 h，可以以濃度依賴性的方式使細胞周期阻滯在G0/G1期并伴隨著S期的減少。表明細胞持續(xù)性的有絲分裂無法通過G1期到達S期，這種細胞周期阻滯是通過增加p53和p-p53蛋白的表達，并降低細胞周期蛋白cyclinD1的表達來實現(xiàn)的。p53則通過調(diào)節(jié)其下游效應基因CIP/WAF1、GADD45和MDM2的轉錄而使得細胞周期阻滯在G0/G1期，CIP/ WAF1表達的產(chǎn)物為p21蛋白，p21的表達是引起G0/G1期阻滯的直接原因[11-12]。p21與細胞周期蛋白家族、周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）家族、增殖細胞細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）構成復合物。抑制復合物中的激酶活性，引起其底物成視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein,RB）的去磷酸化，阻止轉錄因子E2F釋放，使參與與細胞增殖有關蛋白如cyclinD1、cyclinE、PCNA等不能表達，阻滯細胞從G1期進入S期，導致G0/G1期阻滯[13]。

目前細胞凋亡主要通過兩條信號通路：通過調(diào)控Caspase-9起作用的線粒體凋亡通路和通過調(diào)控Caspase-8起作用的死亡受體通路。線粒體凋亡途徑是通過線粒體釋放細胞色素C(cyt-c)激活Caspase-9，繼而激活Caspase-3形成cleaved-Caspase-3 (c-Caspase-3)，從而發(fā)揮激活Ploy(ADP-ribose)polymerase(PARP)作用[14-15]。一旦PARP被激活，其將發(fā)揮“死亡基質(zhì)”的作用，最終導致細胞凋亡。本實驗結果表明，核桃青皮粗提物降低了Caspase-3酶原的表達。此外，Bcl-2家族在線粒體凋亡途徑的調(diào)控中也起到重要作用。Bcl-2家族包括抑制和促進細胞凋亡兩類功能相反的蛋白質(zhì)，如Bcl-2抑制凋亡，Bax促進凋亡，并且，Bax上調(diào)，Bcl-2下調(diào)也會激活Caspase-9和Caspase-3[16]。本實驗結果表明，核桃青皮粗提物作用于KYSE150細胞后，能夠上調(diào)Bax的表達，同時下調(diào)Bcl-2的表達。因此，核桃青皮粗提物通過線粒體凋亡途徑誘導KYSE150細胞凋亡。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，核桃青皮粗提物可以引發(fā)KYSE150細胞G0/G1周期阻滯，并且可以通過線粒體途徑誘導KYSE150細胞凋亡。由此表明，核桃青皮粗提物具有較好的抗食管癌作用，具有廣闊的藥物研發(fā)和臨床應用前景。另一反面，現(xiàn)在核桃青皮是核桃生產(chǎn)中產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物，其價值一直沒有得到充分的開發(fā)和利用，而此次我們對其抗食管癌活性的研究，不但能使核桃青皮變廢為寶，還能減少環(huán)境污染。然而，核桃青皮粗提物阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡的信號轉導通路，以及各個通路之間的聯(lián)系有待進一步研究，并且亟需通過體內(nèi)實驗進一步驗證核桃青皮粗提物抗食管癌的作用。

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（收稿：2016-06-08 修回：2017-01-26）

（責任編輯 王 豐 屈振亮）

Extractives of J.sigillata Green Husks Induce Cell Cycle Arrest and Apoptosis in KYSE150 Cells

LICai-xia,ZHANG Shu-kun,LI Zhi-gang,et al.
Institute of Chinese and Western Medicines for Acute Abdominal Diseases,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

Objective To explore the mechanisms of extractives of J.sigillata green husks in inducing cell-cycle arrest and apoptosis in esophageal cancer cells(KYSE150). Methods MTT assay was used to detect the rate of cell proliferation inhibition by the extractives of J.sigillata green husks.Flow cytometry assay was used to analyze the cell cycle arrest and apoptosis.Western blot assay was used to analyze expression levels of proteins in cell cycle and apoptosis signaling pathways. Results MTT assay indicated that the proliferation inhibition of extractives of J.sigillata green husks on KYSE150 cells was in time and dose dependent manners. When the concentration of extractives of J.sigillata green husks was 100 μ g/mL,the inhibition rates of KYSE150 cell proliferation were 43.69±1.02%,88.73±1.32%and 93.06±2.34%at 24 h,48 h and 72 h,respectively.Flow cytometry results show that the extractives of J.sigillata green husks caused cycle arrest in G0/ G1 phase via up-regulating p53,phospho-p53 and down-regulating cyclinD1.On the other hand,the extractives of J.sigillata green husks induced apoptosis via increasing the protein expression of Bax and decreasing the protein expression of Bcl-2 and Caspase-3.The expression of p53,p-p53 and Bax were increased 1.8±0.07,23.6 ±0.12 and 1.5±0.02 times compared with the control group respectively,while the expression of cyclinD1, Bcl-2 and Caspase were down-regulated 0.3±0.02,0.03±0.005 and 0.1±0.01 times compared with the control group respectively,when the concentration of extractives of J.sigillata green husks was 40 μ g/mL. Conclusion The extractives of J.sigillata green husks triggered G0/G1 phase arrest in KYSE150 cells.In addition,the extractives of J.sigillata green husks induced apoptosis through the mitochondrial apoptotic pathway.

Extractives of J.sigillata green husks；KYSE150 cell；proliferation；cellcycle；apoptosis.

R735.1

A

1007-6948(2017)02-0151-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.02.013

天津市衛(wèi)生局基金項目（2015KY27）

1.天津市中西醫(yī)結合急腹癥研究所細胞及分子生物學實驗室（天津 300100）

2.天津市南開醫(yī)院胸外科（天津 300100）

3.天津科技大學材料科學與化學工程學院（天津 300222）

李志剛，E-mail：zhigli38@hotmail.com