李芬芳 +馬艷弘 趙密珍 黃開(kāi)紅 段云青

摘要：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化草莓多酚的提取工藝條件，并探討草莓多酚的體外抑菌活性。結(jié)果表明：草莓多酚的最佳提取工藝為料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h，乙醇濃度50%，各因素對(duì)多酚得率影響由大到小依次為提取時(shí)間、提取溫度、料液比，最后是乙醇濃度；驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在此條件下草莓多酚得率為2.448 mg/g；所提多酚具有顯著的抑菌效果，其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的最低抑制濃度分別達(dá)0.6、0.8、0.9 mg/mL，且在一定濃度范圍內(nèi)，其抑菌能力與多酚濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：草莓；多酚；有機(jī)溶劑；提取工藝；抑菌活性

中圖分類號(hào)： TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0155-04

收稿日期：2016-02-29

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（15）1021]；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目（編號(hào)：BE2015350）；江蘇省句容市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：NY2016228842）。

作者簡(jiǎn)介：李芬芳（1991—），女，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事生化分析研究。E-mail：lifenfang1991@163.com。

通信作者：段云青，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)與生態(tài)環(huán)境研究。E-mail：duan_yq@163.com。

草莓（Fragaria×ananassa Duck）別稱鳳梨草莓、紅莓、洋莓、地莓，屬薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生草本植物，果實(shí)色澤鮮艷，香味濃郁，柔軟多汁，甜酸適口，是世界上栽培最廣泛的保健漿果，素有水果皇后之美譽(yù)[1]。草莓果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，其漿果富含多糖、維生素、礦質(zhì)元素，還富含花青素、黃酮、單寧類、酚酸等生物活性物質(zhì)[2-4]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，其抗氧化能力高達(dá)蘋果、桃、梨、番茄、柑橘等園藝產(chǎn)品的2～11倍[5]。酚類物質(zhì)為草莓中最主要的抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抑菌、抑制高血壓和高血脂、預(yù)防心血管疾病等多種生理功效[6-9]。隨著人們對(duì)食品綠色、健康、營(yíng)養(yǎng)、保健等需求的提高，植物多酚等次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，其開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景極其廣闊。

我國(guó)是世界草莓生產(chǎn)大國(guó)，擁有最大的栽培面積和廣泛的優(yōu)質(zhì)草莓品種資源，近年來(lái)，通過(guò)大量引進(jìn)國(guó)外優(yōu)質(zhì)草莓品種，我國(guó)草莓的種類和數(shù)量已經(jīng)位于世界前列。國(guó)內(nèi)對(duì)草莓的食用形式、貯藏、釆后保鮮等研究較多，但對(duì)草莓的活性物質(zhì)及其生理功能的研究與國(guó)際先進(jìn)水平仍存在一定的差距。

植物多酚的提取分離及生物活性已成為眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。植物多酚的提取方法包括溶劑萃取法、超聲輔助提取法、微波提取法以及酶解輔助提取法等[10-12]。其中溶劑萃取法因其工藝簡(jiǎn)便、成本低廉、便于后續(xù)分離純化等優(yōu)點(diǎn)成為目前國(guó)內(nèi)使用最廣泛的多酚提取方法。目前國(guó)內(nèi)多酚提取、分離、生物活性的研究主要集中在茶多酚、蘋果多酚等少數(shù)幾種，而有關(guān)草莓多酚的高效提取與抗菌活性卻鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)系統(tǒng)研究了草莓多酚的有機(jī)溶劑提取工藝及其抑菌活性，以期為草莓多酚的生產(chǎn)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

草莓，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、沙門氏菌（Salmonella），由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供；福林酚試劑（1N），購(gòu)自源葉生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、沒(méi)食子酸、碳酸鈉、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、瓊脂，均為分析純?cè)噭?gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2儀器與設(shè)備

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；HJ-6A多頭磁力攪拌器（江蘇常州國(guó)華儀器有限公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；JJ-500電子天平（江蘇常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；MP220 pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LRH-150生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)（江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ZD-F12真空冷凍干燥機(jī)（江蘇南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司）。

1.3方法

1.3.1草莓多酚提取方法

將新鮮草莓洗凈、瀝干水分、破碎打漿，與一定濃度的乙醇溶液混合均勻，恒溫提取一定時(shí)間，4 000 r/min離心20 min，沉淀再重復(fù)提取1次，合并2次上清，得多酚提取液。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，AB-8大孔樹(shù)脂純化[13]，50%乙醇溶液洗脫2次，合并洗脫液，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空冷凍干燥至恒質(zhì)量，得草莓多酚粉。

1.3.2提取工藝單因素試驗(yàn)

一定量的草莓打漿后放入250 mL錐形瓶中，以不同濃度乙醇溶液為提取液提取多酚，重復(fù)提取2次，研究料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間等4個(gè)因素對(duì)草莓多酚提取率的影響，確定每一因素的最佳水平。具體方法如下。

料液比：乙醇濃度70%，料液比分別為1 ∶[KG-*3]5、1 ∶[KG-*3]10、1 ∶[KG-*3]15、1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]25、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]35（g ∶[KG-*3]mL），提取時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃。

乙醇濃度：乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL，提取時(shí)間2 h，提取溫度50 ℃。

提取溫度：乙醇濃度為70%，料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL，提取溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，提取時(shí)間2 h。

提取時(shí)間：乙醇濃度為70%，料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、35、4.0 h。

1.3.3提取工藝正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，每因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)（表1），計(jì)算多酚得率，以確定草莓多酚最佳提取條件。

1.3.4草莓多酚得率測(cè)定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定。

1.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別取1 mL，加蒸餾水5 mL、Folin-Ciocalteu顯色劑1 mL、7.5%碳酸鈉溶液 3 mL，混勻，45 ℃水浴1.5 h后，在760 nm處測(cè)吸光度。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為y=0.011 3x+0.002，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 8。

1.3.4.2多酚提取得率的測(cè)定

取草莓多酚提取液1 mL，依次加入蒸餾水5 mL、Folin-Ciocalteu顯色劑1 mL、7.5%碳酸鈉溶液3 mL，混勻，45 ℃水浴1.5 h，在760 nm處測(cè)吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算草莓多酚含量，再按照如下公式計(jì)算多酚提取得率：

[JZ]多酚得率（按沒(méi)食子酸計(jì)）（mg/g）=（C×V/m）×100%，

式中：C為比色杯中多酚質(zhì)量濃度（mg/mL），V為多酚提取液總體積（mL）；m為草莓總質(zhì)量（g）。

1.3.5草莓多酚體外抑菌試驗(yàn)

預(yù)先將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌從斜面轉(zhuǎn)接至已滅菌的LB培養(yǎng)基中活化，然后分別挑取菌苔，用無(wú)菌水制成含菌數(shù)約為106 CFU/mL的菌懸液。于無(wú)菌條件下分別進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)和最小抑菌濃度試驗(yàn)。

抑菌圈試驗(yàn)[16]：以無(wú)菌水作溶劑，準(zhǔn)確稱取一定量草莓多酚粉，分別配制濃度為0.056、0.112、0.224、0.448、0.896 mg/mL 的草莓多酚溶液。將無(wú)菌濾紙片（直徑6mm）放入多酚溶液中，4 ℃條件下浸泡2 h。將LB培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，凝固后分別取0.1 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌懸液滴于培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，靜置10 min。將分別浸有不同濃度草莓多酚溶液的濾紙片均勻放置于平板上，以浸有無(wú)菌生理鹽水的濾紙片為對(duì)照，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察濾紙片周圍的抑菌圈，并通過(guò)測(cè)定其抑菌直徑比較不同濃度多酚溶液的抑菌效果。

最小抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)：參照張赟彬等的方法[17]將草莓多酚加入50 ℃無(wú)菌LB培養(yǎng)基，混和均勻，使其在培養(yǎng)基的終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/mL，將含有不同濃度草莓多酚的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，凝固后分別滴加大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌懸液各0.5 mL，用涂布棒均勻涂布，靜置10 min后在 37 ℃ 下培養(yǎng)24 h，找出肉眼未見(jiàn)有菌生長(zhǎng)的草莓多酚濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

2結(jié)果與分析

2.1草莓多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1料液比對(duì)草莓多酚得率的影響

由圖1可見(jiàn)，在料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL以內(nèi)，隨溶劑量逐漸增大，多酚提取率逐漸增加；當(dāng)達(dá)料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL后，繼續(xù)增大溶劑量，提取率增加不再明顯。較高的溶劑量有利于多酚類物質(zhì)的溶出，但是溶劑量過(guò)大也會(huì)造成資源的浪費(fèi)并對(duì)后續(xù)分離純化造成不利影響。考慮到物料及溶劑的利用率，最終確定最佳提取料液比為1 g ∶[KG-*3]20 mL。

[TPLFF1.tif][FK）]

2.1.2乙醇濃度對(duì)草莓多酚得率的影響

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)乙醇濃度小于50%時(shí)，隨著乙醇濃度升高，總多酚提取率逐漸提高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，總多酚的提取率達(dá)到最大，此后隨著乙醇濃度升高，提取率逐漸減小。可能是由于過(guò)高濃度的乙醇溶液會(huì)引起細(xì)胞蛋白質(zhì)變性，影響多酚類物質(zhì)溶出，因而提取率降低[18]。最終確定最佳提取乙醇濃度為50%。

2.1.3提取溫度對(duì)草莓多酚得率的影響

由圖3可見(jiàn)，小于60 ℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度升高，提取率逐漸增大，當(dāng)溫度大于60 ℃后，多酚得率呈下降趨勢(shì)。表明溫度升高有利于多酚的溶出，但是溫度太高，草莓中酚類物質(zhì)有可能因溫度過(guò)高發(fā)生氧化等變化[19]。從節(jié)能經(jīng)濟(jì)出發(fā)，確定最佳提取溫度為 60 ℃。

[TPLFF3.tif][FK）]

2.1.4[JP2]提取時(shí)間對(duì)草莓多酚提取得率的影響

由圖4可見(jiàn)，在提取時(shí)間2 h以內(nèi)，多酚提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，超過(guò)2 h以后，提取率增加漸趨平緩。表明充足的提取時(shí)間可以使溶劑充分接觸，從而提高得率，當(dāng)時(shí)間超過(guò)2 h后，多酚溶出基本達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，確定最佳提取時(shí)間為2 h。[JP]

[FK（W12][TPLFF4.tif][FK）]

2.2草莓多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化多酚提取工藝，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2極差R可知，4個(gè)因素對(duì)草莓多酚提取得率影響的主次關(guān)系為D>C>A>B，即提取時(shí)間>提取溫度>料液比>乙醇濃度。草莓多酚提取的最佳組合為A1B2C2D2，即料液比為1 g ∶[KG-*3]20 mL，提取時(shí)間2 h，乙醇濃度50%，提取60 ℃。按照此條件進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得草莓多酚提取得率（按沒(méi)食子酸計(jì)）為2.448 mg/g。

2.3草莓多酚的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1不同濃度草莓多酚抑菌效果

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌為供試菌株，通過(guò)檢測(cè)抑菌圈直徑比較 0.056、0.112、0.224、0.448、0.896 mg/mL等不同濃度的草莓多酚溶液對(duì)3種菌的抑菌效果。由圖5和表3可知，草莓多酚對(duì)3種試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，且3種試驗(yàn)菌的抑菌圈直徑大小與多酚濃度呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；草莓多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最為明顯，對(duì)3種菌的抑菌能力強(qiáng)弱排序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌>大腸桿菌>沙門氏菌。

2.3.2草莓多酚的最低抑菌濃度分析

由表4可知，草莓多酚對(duì)不同微生物的生長(zhǎng)抑制作用存在較大差異，0.9 mg/mL以上濃度才會(huì)對(duì)3種供試均有抑菌效果。在較低濃度條件下，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌效果次之，而對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最差。對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC分別為0.9、0.6、0.8 mg/mL。從表4還可知，隨著濃度降低，平皿上菌落生長(zhǎng)越來(lái)越多。說(shuō)明多酚濃度與其抑菌效果呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

3結(jié)論

草莓是國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上深受消費(fèi)者喜愛(ài)的特色保健漿果，但草莓的易腐特性常常會(huì)導(dǎo)致草莓豐產(chǎn)不豐收。因此，采用深加工技術(shù)開(kāi)發(fā)各類草莓多酚營(yíng)養(yǎng)保健品是草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然途徑。本試驗(yàn)采用常規(guī)溶劑法提取草莓多酚，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法確定草莓多酚最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL、乙醇濃度50%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間 2 h。各因素對(duì)多酚得率的影響從大到小依次為提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度。該最佳工藝條件下草莓多酚的提取率（按沒(méi)食子酸計(jì)）為2.448 mg/g。

多酚是多羥基酚類化合物的總稱，具有廣譜的抗菌活性，分子中的酚羥基是抑菌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，多酚與蛋白質(zhì)分子的多點(diǎn)結(jié)合作用，及其通過(guò)抑制酶活性而抑制代謝過(guò)程，是其阻止并抑制微生物浸染、構(gòu)成抗菌活性的重要原因。此外，多酚還可以通過(guò)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、增加細(xì)胞通透性、影響細(xì)胞能量代謝從而對(duì)微生物起毒害作用[20-21]。近年來(lái)茶多酚、蘋果多酚等物質(zhì)的抑菌作用時(shí)有報(bào)道，但有關(guān)草莓多酚的抑菌活性還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)濾紙片法抑菌試驗(yàn)檢測(cè)草莓多酚對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均有抑菌能力；對(duì)3種菌抑制能力由大到小排序依次為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>沙門氏菌；對(duì)3種細(xì)菌的最低抑制濃度分別為金黃色葡萄球菌0.6 mg/mL、大腸桿菌0.8 mg/mL、沙門氏菌0.9 mg/mL。

總之，本試驗(yàn)優(yōu)化的草莓多酚提取工藝安全高效，所得草莓多酚具有良好的抗菌活性，可作為天然的植物抗菌劑應(yīng)用于食品防腐與醫(yī)療保健。但草莓多酚作為由多種酚類物質(zhì)組成的混合物，其中每種物質(zhì)的抑菌活性和作用機(jī)理如何、是否存在協(xié)同增效作用等，仍需要進(jìn)一步深入研究。

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