芒果ANR基因的克隆及其表達分析

李先良+趙志常 +高愛平 +陳業(yè)淵 +黃建峰 黨志國 羅睿雄

摘要：花青素還原酶（anthocyanidin reductase，簡稱ANR）基因是植物產(chǎn)生原花青素的關(guān)鍵基因，對于研究原花青素的代謝有重要的作用。根據(jù)已經(jīng)報道的ANR基因的序列設(shè)計兼并引物，采用3′cDNA末端快速擴增（3′RACE）、5′cDNA末端快速擴增（5′RACE）方法，從芒果果實內(nèi)克隆到1個ANR基因，其全長cDNA序列為1 201 bp。該基因開放閱讀框為1 008 bp，編碼335個氨基酸，等電點為5.41，分子量為36.33 ku。對基因組擴增得到了1 810 bp長度的片段，分析發(fā)現(xiàn)，該基因含有5個內(nèi)含子，內(nèi)含子位置分別為130～646 bp、733～814 bp、1 017～1 080 bp、1 259～1 349 bp、1 563～1 651 bp。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白與可可、葡萄等果樹具有較近的親緣關(guān)系。對不同芒果品種中ANR基因的表達進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因在綠色的桂七品種中表達量較高，而在紅色的貴妃品種中表達量較低。

關(guān)鍵詞：芒果；原花青素；花青素還原酶（ANR）；基因克?。槐磉_分析

中圖分類號：S667.701；Q785文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）04-0022-04

原花青素是苯丙醇代謝途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有消除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、調(diào)解免疫、防止體內(nèi)過氧化等功能。原花青素的抗氧化性能比維生素C高20倍，比維生素E高50倍。此外，原花青素對于水果的口感，以及食草動物對牧草的進食量等都有一定的影響[1-4]?；ㄇ嗨剡€原酶（anthocyanidin reductase，簡稱ANR）是原花青素代謝途徑中的關(guān)鍵酶，可催化花青素轉(zhuǎn)化為表兒茶素（2，3-順式黃烷3-醇），進一步向液泡中轉(zhuǎn)運并聚合成為原花青素。ANR作為花青素代謝途徑上的負調(diào)控基因，其表達對花瓣、果實等組織的呈色有重要的影響[5]。

目前，人們已經(jīng)從擬南芥、銀杏、苦蕎麥、葡萄、蘋果、草莓、百脈根、茶、苜蓿等多種植物中克隆出ANR基因[6-11]。芒果是重要的熱帶、亞熱帶果樹，其果實色彩多樣，如綠色、黃色、淺黃色、紅色、橙紅色等[12]，其果實富含類胡蘿卜素、花青素等物質(zhì)。關(guān)于芒果果實的ANR基因研究未見報道，本研究采用cDNA末端快速擴增（RACE）方法從芒果果實中克隆得到1個ANR基因，旨在深入探討該基因在芒果果實花青素合成中的作用機制及對果實著色的影響，從而深入揭示該基因在芒果果實花色形成中的分子機制，為芒果果實著色提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

以貴妃芒果的果實為試驗材料，取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所的農(nóng)業(yè)部芒果種質(zhì)資源圃。大腸桿菌DH5а，為筆者所在實驗室保存。引物由上海英駿生物工程技術(shù)有限公司合成。焦碳酸二乙酯（DEPC）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素（Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）、載體pMD19-T、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1芒果DNA提取參照王家保等方法[13]提取芒果DNA，用無菌雙蒸水溶解，通過核酸蛋白測定儀進行純度檢測后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2芒果總RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的總RNA提取試劑盒，從芒果果肉中提取總RNA，用RNase-free無菌水溶解，用寶生物工程（大連）有限公司的DNase試劑盒去除DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和純度，并用核酸蛋白測定儀對所得RNA的D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm及濃度進行測定，然后用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。

1.2.3PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；95 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。25 μL反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR buffer（含Mg2+）、25 ng DNA模板、20 μmol 引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。反應(yīng)體系在Eppendorf PCR儀上擴增后取10 μL上樣電泳，采用GelRed染色后在紫外凝膠成像儀上觀察、拍照分析。

1.2.4ANR基因全長cDNA和基因組DNA序列的獲得以上述反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA為模板，參照該試劑盒的說明書進行cDNA 3′端、5′端cDNA的擴增。根據(jù)擴增cDNA末端片段的測序結(jié)果，分別設(shè)計2條上游引物，以接頭為錨定引物進行半巢式PCR反應(yīng)。將3′端、5′端的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定所得到的片段大小是否與預(yù)測的片段大小一致。對目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序，并根據(jù)已知片段和得到的cDNA 3′端、5′端的序列結(jié)果拼接該基因的全長cDNA。以上述cDNA和提取的基因組DNA為模板，設(shè)計特異引物，進行全長cDNA和基因組DNA序列的擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系25 μL，從中取6 μL PCR產(chǎn)物，加入0.2 mL PCR管中，加入1 μL 6×Loading Buffer，用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定擴增片段大小是否正確。在確定擴增片段大小正確后對PCR產(chǎn)物進行普通瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit，TaKaRa）回收膠塊中的目的片段，回收方法具體操作參照試劑盒說明書上的步驟進行。取5 μL回收純化后的目的DNA產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖電泳檢測，以檢驗回收效果及大致含量，并根據(jù)回收產(chǎn)物片段大小及其有效濃度，取適量回收純化的產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T（TaKaRa）連接，目的DNA與克隆載體的摩爾比控制在3 ∶[KG-*3]1左右。反應(yīng)混合液包括1 μL pMD19-T載體、4 μL純化后的DNA、5 μL連接液（Ligation Solution） I，混合均勻后在16 ℃下恒溫水浴過夜連接。

1.2.5ANR基因氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征和分子進化的分析將所擴增得到的全長得序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上進行序列比對，確定該基因是否為ANR基因，并進行其他物種ANR基因的比對，采用DNAMAN軟件分析基因核苷酸、氨基酸的結(jié)構(gòu)特征和同源性，并分析該基因所對應(yīng)的氨基酸序列，進行多序列比較并構(gòu)建系統(tǒng)樹。

1.2.6表達分析分別提取不同芒果品種的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并采用Primer 5.0設(shè)計引物進行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的擴增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列：actin-F，5′-AATGGAAGGAATGGTCAAGGC-3′；actin-R，5′-TGCCAGATTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因擴增采用的引物：ANR-F，5′-GCCAGCATACCATGCACATA-3′；ANR-R，5′-ATACAATGGAGCAACGTAAAT-3′。將PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并采用Quantity One軟件進行數(shù)據(jù)分析，得出相對表達量。

2結(jié)果與分析

2.1ANR基因的獲得

根據(jù)得到的3′、5′端序列信息進行拼接，最后得到ANR基因的全長cDNA序列。設(shè)計特異引物，進行全長cDNA、基因組DNA序列的擴增，電泳結(jié)果如圖1所示。將電泳條帶回收測序后，得到ANR基因的cDNA全長序列為1 201 bp，分析發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框為1 008 bp，編碼335個氨基酸序列（圖2），其分子量為36.33 ku，等電點為5.41。通過與NCBI上已經(jīng)登錄的蘋果、草莓、荔枝的ANR蛋白序列進行比對，發(fā)現(xiàn)克隆的基因為ANR基因（圖3）。對基因組DNA擴增得到約 1 810 bp 的片段，通過與cDNA序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因含有5個內(nèi)含子，堿基位置分別為130～646 bp、733～814 bp、1 017～1 080 bp、1 259～1 349 bp、1 563～1 651 bp（圖4）。

2.2芒果ANR基因的部分生物信息學分析

采用DNAMAN進行ANR蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)芒果ANR蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件主要以無規(guī)則卷曲、β-折疊為主，也具有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖5）。采用 BioEdit 軟件的

Kyte、Doolittle算法對ANR蛋白的親水/疏水性值（正值表示疏水性，負值表示親水性）進行分析表明，ANR蛋白所含氨基酸的親水/疏水性值主要介于-1.8～2.1之間。采用DNAMAN5軟件分析發(fā)現(xiàn)，芒果ANR蛋白與可可、葡萄等果樹的蛋白序列聚為一類；草莓、蘋果、西洋梨、柿和藍莓等果樹也可以聚為同一類（圖7）。

2.3ANR基因的RT-PCR分析

分別提取不同著色程度芒果的果皮RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，通過上述RT-PCR分析的引物進行擴增，對擴增結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)：該基因在綠色桂七品種的果實中表達量較多，在黃色果皮中次之，而在紅色果皮貴妃中相對表達量較少（圖8）， 初步推斷ANR基因可能與紅色果實的原花色素等含

量有一定的關(guān)系。

3討論

ANR基因最初從擬南芥中克隆并命名[14]，ANR基因?qū)ΨN皮色素積累有重要作用，是調(diào)節(jié)種皮色澤的負調(diào)控基因。該基因在擬南芥突變體的種皮內(nèi)因積累花青素而顯紅色，但類黃酮含量與正常植株含量相差不多[15-17]。通過體外重組ANR能將非手性花青素催化成2，3-順-（2R，3R）-黃烷-3-醇（如表兒茶素）、2，3-反-（2R，3R）-黃烷-3-醇（如內(nèi)兒茶素）[18]。Bogs等對ANR基因在葡萄中的表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)該基因在葉片、花、果實中均有表達，且隨著葉片、花、果實的生長，原花色素不斷增加，在成熟的果實中ANR基因表達量較少，原花色素也不再增加[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，該基因在綠色的桂七芒果品種中表達量較高，而在紅色的貴妃品種中表達量較低，這與果皮中花色素的含量呈現(xiàn)相反的趨勢。葡萄ANR基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達，表現(xiàn)為表達量較高的花瓣顏色減弱，花青素含量減少[19]。因此推測，ANR基因的表達在花青素和原花青素之間的轉(zhuǎn)化中具有重要作用。芒果ANR基因是芒果原花色素合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因之一，它對芒果果皮色澤的影響具有重要作用，而對芒果果實色澤功能的深入研究須要進一步通過轉(zhuǎn)基因植物表達的驗證。

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