彭思遠，曾杰宏，謝博文，劉錚凱，張 豹，呂 品，聶盛丹，蔣 波

（湖南師范大學第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院，長沙 410005）

阻斷ErbB4受體對人膽管細胞癌QBC939細胞系增殖與轉(zhuǎn)移的影響

彭思遠，曾杰宏，謝博文，劉錚凱，張 豹，呂 品，聶盛丹，蔣 波

（湖南師范大學第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院，長沙 410005）

目的：通過體外培養(yǎng)人膽管癌QBC939細胞系，阻斷ErbB4受體，檢測腫瘤生物學行為的改變，從而探討人類第4表皮生長因子（ErbB4）受體介導人膽管細胞癌腫瘤生物學行為的分子機制。方法：體外培養(yǎng)人膽管癌QBC939細胞系細胞，分別加入終濃度為0μmol/L，1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L的AG1478阻斷膽管癌細胞ErbB4受體，使用CCK-8法測量各組膽管癌細胞增殖情況，然后利用SPSS軟件計算AG1478對人膽管癌QBC939細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50值）；根據(jù)IC50值選擇使用0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L AG1478阻斷膽管癌細胞ErbB4受體，使用劃痕實驗檢測各組膽管癌細胞遷移能力的變化。分別使用0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L濃度AG1478阻斷膽管癌細胞ErbB4受體，使用Transwell小室法實驗檢測各組膽管癌細胞侵襲能力的變化。結(jié)果：AG1478以濃度依賴方式抑制QBC939細胞增殖，其IC50值為：49.14μmol/L；AG1478抑制ErbB4受體后，膽管癌QBC939細胞的遷移、侵襲能力減弱。結(jié)論：在體外抑制ErbB4受體能使膽管癌腫瘤細胞生長、遷移、侵襲能力減弱；ErBb4在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，ErbB4可能成為膽管癌分子治療的新靶點。

膽管癌；ErbB4；增殖；侵襲

膽管癌（cholangiocarcinoma，CC）是一類起源于肝內(nèi)外膽管上皮細胞的惡性腫瘤［1］，約占膽道惡性腫瘤的1/3，在所有消化道惡性腫瘤中所占的比例約為3%［2］。膽管癌在歐美地區(qū)較為少見［3］，但是在我國和東南亞地區(qū)發(fā)病較多。因此，膽管癌的相關(guān)研究對我國具有重要意義。根治性切除術(shù)仍是目前膽管癌的主要治療方式。盡管近年來外科技術(shù)進步巨大，膽管癌圍手術(shù)期死亡率日益減少［4，5］，但根治切除術(shù)后預(yù)后仍然較差。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積大、肝內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤是膽管癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素［6，7］?？梢娫谀懝馨┑陌l(fā)生發(fā)展中，其腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移對于患者的預(yù)后有重要影響。因此，研究膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移的分子機制，由此探討新的靶向治療方法對改善患者預(yù)后有重要意義。在本課題組的前期研究中［8］發(fā)現(xiàn) ErbB4在膽管癌組織中存在過表達，ErbB4表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。本研究擬通過體外培養(yǎng)人膽管癌QBC939細胞系，阻斷ErbB4受體，檢測腫瘤生物學行為的改變，從而探討ErbB4受體介導人膽管細胞癌腫瘤生物學行為的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人膽管癌細胞系QBC-939細胞購自美國ATCC公司，由湖南省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所保存。AG1478購自德國SIGMA公司。CCK-8檢測試劑盒購自中國唯贊公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞免疫熒光檢測QBC-939細胞中ErbB4蛋白的表達 取生長狀態(tài)良好的QBC-939細胞，用PBS洗滌細胞3次，加入4% 多聚甲醛固定10min。PBS洗滌3次，0.1% Triton X-100-PBS透化10min。PBS洗滌3次，用2% BSA 37℃孵育30min。PBS洗滌3次，ErbB4抗體（1：200稀釋）4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，用熒光標記的二抗37℃下孵育60min。PBS洗滌3次，DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.2.2 CCK-8法檢測AG1478對QBC939細胞增殖影響及IC50值 取對數(shù)生長期QBC939細胞系細胞，在96孔板中配置200μL 的細胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時，吸棄培養(yǎng)基，更換為含不同濃度AG1478培養(yǎng)基，每孔200μL，作為實驗組。將培養(yǎng)的細胞懸液，不添加AG1478培養(yǎng)基，作為對照組。將無細胞以及AG1478的培養(yǎng)基作為空白組。將三組每孔加入200μL新鮮配制的含CCK-8的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，用酶標儀上以檢測波長為450nm測定吸光度（A）值。相對細胞存活率（%）按照下列公式計算：細胞存活率（%）=［（A實驗-A空白）/（A對照-A空白）］×100%。以上實驗重復(fù)2次。然后輸入對應(yīng)的濃度及細胞存活率用SPSS軟件計算IC50值。

1.2.3 劃痕法檢測QBC939細胞遷移能力 取人膽管癌QBC-939細胞系細胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h至融合度為80%；然后在培養(yǎng)板中央制造相同寬度的劃痕，更換為含藥物的無血清相應(yīng)條件培養(yǎng)基處理48h至對照組細胞接近融合，于0、24、48h拍照劃痕，并計算在劃痕區(qū)的細胞數(shù)目；設(shè)定未處理QBC-939細胞系細胞的遷移細胞數(shù)為100%計算相對遷移細胞百分率：細胞遷移率（%）=條件培養(yǎng)基處理組遷移細胞均數(shù)/未處理組遷移細胞均數(shù)×100%。

1.2.4 Transwell小室結(jié)合Matrigel檢測QBC939細胞侵襲能力 取人膽管癌QBC939細胞，用含不同濃度AG1478培養(yǎng)基處理24 h；然后，取包被Matrigel基質(zhì)膠膜的Transwell小室。下室加入600 μL含10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，Transwell小室的上室內(nèi)接種含10000個細胞的無血清培養(yǎng)基400 μL。24 h后，用棉簽清除未侵襲通過Matrigel基質(zhì)膠的細胞。用4%多聚甲醛固定膜下室面上的細胞，并進行瑞氏-姬姆薩染色。在光學顯微鏡下，計數(shù)每孔通過膜侵入至下室面的細胞數(shù)目，拍照記錄。

1.2.5 Western Blot分析 取經(jīng)相應(yīng)處理的細胞，用PBS洗滌細胞3次，加入500 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，刮取、收集并裂解細胞。細胞裂解液經(jīng)13200× g、4°C 條件下離心10 min，制備全細胞蛋白提取物。用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白提取物的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。在5%（w/v）脫脂牛奶/PBST中進行膜封閉，隨后，用實驗材料部分描述的一抗在4°C條件下孵育過夜。用PBST洗膜3次，用過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗孵育上述PVDF膜1 h。以增強化學發(fā)光試劑盒檢測信號。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)錄入SPSS 16.0軟件，建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，用One Way ANOVA方式行方差分析。首先進行方差齊性檢驗，多組均數(shù)比較采用LSD法；在方差不齊時，多組均數(shù)間比較采用Turkey's檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人膽管癌細胞系 QBC939的培養(yǎng)及ErbB4受體的表達 為了檢測ErbB4蛋白在人膽管細胞癌QBC939細胞系細胞中的表達，采用細胞免疫熒光間標的方法。結(jié)果顯示，ErbB4蛋白在細胞中呈陽性表達，且表達于細胞核外（圖1）。

圖1 人膽管癌QBC939細胞系細胞ErbB4蛋白表達的熒光顯微鏡圖像（×200）藍色圖像為細胞核，紅色信號為ErbB4蛋白

2.2 AG1478對人膽管癌QBC939細胞系細胞增殖的影響及IC50值 為了確定AG1478對QBC939細胞產(chǎn)生作用的最佳時間和濃度區(qū)間，在藥物處理24h后，CCK-8法檢測不同濃度AG1478（1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，25μmol/L，50μmol/L，75μmol/L，100μmol/L）對QBC939細胞存活率的影響。不同濃度AG1478對細胞存活率結(jié)果如表1所示。SPSS軟件計算IC50值為49.14μmol/L。

表1 不同濃度AG1478對細胞存活率（n=3）

2.3 AG1478對人膽管癌QBC939細胞系細胞遷移的影響 劃痕法檢測AG1478（0μmol/L，25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）對人膽管癌QBC939細胞系細胞遷移的影響。結(jié)果表明：與未用藥物處理的QBC939細胞相比，AG1478處理后，QBC939細胞的細胞融合能力明顯減弱。

圖2 AG1478對膽管癌細胞遷移能力的影響（×100）

劃痕法試驗分別檢測未處理（對照）和AG1478 （25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）處理的人膽管癌細胞系細胞遷移能力。AG1478（25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）與AG1478（0μmol/L）人膽管癌細胞系細胞比較，P＜0.05

圖3 AG1478抑制膽管癌細胞遷移作用

2.4 AG1478對人膽管癌QBC939細胞系細胞侵襲的影響 Transwell小室體外侵襲法檢測AG1478（25μmol/ L，50μmol/L和75μmol/L）對人膽管癌QBC939細胞系細胞侵襲的影響。結(jié)果表明：與未用藥物處理的QBC939細胞相比，AG1478處理后，侵襲進入膜下方的QBC939細胞明顯減少。

圖4 AG1478對膽管癌細胞侵襲能力的影響（×200）

圖5 AG1478抑制膽管癌細胞侵襲作用Transwell小室體外細胞侵襲試驗分別檢測未處理（對照）和AG1478 （25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）處理的人膽管癌細胞系細胞侵襲能力。AG1478（25μmol/L，50μmol/L和75μmol/L）與AG1478（0μmol/L）人膽管癌細胞系細胞比較，P＜0.05

3 討論

膽管癌是膽道系最常見的惡性腫瘤之一。在臨床上，根據(jù)解剖位置的不同可以分為肝內(nèi)膽管癌、肝門膽管癌以及肝外膽管癌［9］。近年來膽管癌的發(fā)病率及死亡數(shù)正逐年上升［10］，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率約為（1～10）/10萬［11］。但是，膽管癌早期診斷困難，大多數(shù)病人直到晚期出現(xiàn)了無痛性黃疸、體重下降以及膽管炎等癥狀后才被發(fā)現(xiàn)［12，13］。手術(shù)切除仍然是目前膽管癌治療的最佳方式。文獻報道膽管癌行早期根治性切除術(shù)，術(shù)后的5年生存率低于30%［14］。研究顯示膽管癌細胞對放化療不敏感［15］。因此，我們急需尋求新的治療方法以改善膽管癌患者的預(yù)后。分子靶向治療已成為目前膽管癌治療的研究方向。

ErbB4受體為人類第4表皮生長因子受體，它屬于表皮生長因子受體家族中的一員，該蛋白在正常的人體組織中有不同的表達。根據(jù)國外文獻報道，ErbB4蛋白在多種腫瘤組織中存在過度表達［16-18］，提示該蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但是ErbB4在膽管癌中的表達未見文獻報道。在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，ErbB4在膽管癌患者組織標本中存在過表達，提示該蛋白在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。綜合上述文獻和前期研究結(jié)果我們得出：ErbB4在膽管癌組織中存在過表達（圖1），ErbB4表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及不良預(yù)后相關(guān)。

在本研究中CCK-8結(jié)果顯示，根據(jù)不同濃度AG1478組細胞存活率平均值，計算出的IC50值為49.14μmol/L。結(jié)果提示，阻斷ErbB4受體能使膽管癌細胞增值能力減弱。劃痕試驗結(jié)果顯示，膽管癌細胞的遷移能力隨AG1478濃度升高逐漸減弱，提示阻斷ErbB4受體的表達能引起膽管癌細胞遷移能力減弱。為了進一步探討阻斷ErbB4對膽管癌細胞侵襲能力的影響，我們進行了Transwell小室體外細胞侵襲試驗。結(jié)果顯示，阻斷ErbB4受體的表達能引起膽管癌細胞侵襲能力逐漸減弱。這些實驗結(jié)果均支持我們提出的假說，即ErbB4受體能通過介導其下游信號通路，增強膽管癌細胞的增殖、遷移與侵襲能力。

綜上所述，本研究通過在體外抑制ErbB4受體，檢測發(fā)現(xiàn)膽管癌腫瘤細胞生長、遷移、侵襲的能力明顯減弱，從而證明ErBb4在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，ErbB4可能成為膽管癌分子治療的新靶點。誠然，本文僅為對細胞學的基礎(chǔ)實驗研究，抗ErbB4單克隆抗體相關(guān)藥物在體內(nèi)的抑瘤效果如何，這尚有待于進一步的研究。

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Effects of blockade of ErbB4 on proliferation, migration, invasiveness in human cholangiocarcinoma QBC939 cell line

Peng Si-yuan, Zeng Jie-hong, Xie Bo-wen, Liu Zheng-kai, Zhang Bao, Lv Pin, Nie Sheng-dan, Jiang Bo
(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410005, China)

Objective Human cholangiocarcinoma QBC939 cells were cultured in vitro, blockade of ErbB4, to investigate the molecular mechanisms that ErbB4 effects on oncobiology. Methods Human cholangiocarcinoma QBC939 cells were cultured in vitro, 0μmol/L, 1μmol/L, 5μmol/L, 10μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L, 100μmol/L AG1478 were blocked ErbB4 receptor, the proliferation of cholangiocarcinoma cells were measured by CCK-8 assay, moreover, median inhibitory concentration (IC50) of AG1478 in cholangiocarcinoma cells were calculate with SPPS software. After treating with 0μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L AG1478, wound-scratch assay was used to detect the ability of migration, Transwell chamber assay was used to detectd the ability of invasiveness of cholangiocarcinoma cells. Results AG1478(0μmol/L, 1μmol/L, 5μmol/L, 10μmol/L, 25μmol/L, 50μmol/L, 75μmol/L, 100μmol/L) inhibited QBC939 cell proliferation, in a dose-dependent manner, IC50 value is 49.14μmol/L. After inhibiting ErbB4 receptor, the migration and invesiveness of QBC939 cells were attenuated. Conclusion After inhibiting ErbB4 receptor, the proliferation, migration and invasiveness of QBC939 cells were attenuated. The study indirectly indicates that ErbB4 may play a significant role in cholangiocarcinoma and may serve as a molecular target for anticancer therapy.

cholangiocarcinoma; ErbB4; roliferation; invasion

R735.8

A

1673-016X（2017）02-0023-04

2016-12-11

湖南省衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃資助項目（B2012-088）；湖南省教育廳重點項目（15A114）

蔣波，E-mail:jiangbo@medmail.com.cn