陳 文，杜明月，劉浩然

(1.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，惠州 516025; 2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082)

高效液相色譜法測(cè)定木姜葉柯水提取物中根皮苷的含量

陳 文1，杜明月2，劉浩然2

(1.惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，惠州 516025; 2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082)

目的：建立木姜葉柯水提取物中根皮苷的高效液相檢測(cè)方法。方法：取木姜葉柯水提取物以甲醇溶解后，用高效液相色譜法測(cè)定。色譜條件：Kromosi-C18色譜柱；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；流動(dòng)相：甲醇-水 (47：53)；流速：1 mL/min；定量環(huán)進(jìn)樣20 μL；柱溫32 ℃。結(jié)果：根皮苷濃度在6.4～102.4 ug/mL范圍內(nèi)線性良好，r=0.9998，其平均回收率分別為98.83±0.94%。結(jié)論：該法專屬性好，回收率高，適合于木姜葉柯中根皮苷的質(zhì)量控制。

木姜葉柯；根皮苷；高效液相

木姜葉柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun. 為殼斗科植物，分布于越南、緬甸、老撾以及中國(guó)大陸秦嶺以南各省區(qū)［1］?，F(xiàn)代研究表明，木姜葉柯含有較多的黃酮類成分［2］。其中較為特殊的二氫查耳酮類根皮苷是一種具有降血糖作用的活性成份［3］，以根皮苷為先導(dǎo)化合物合成的坎格列凈目前已作為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑應(yīng)用于臨床［4］。

根皮苷很早就被人從植物中發(fā)現(xiàn)，目前多從蘋果皮及樹枝中提?。?］。此外，湖北海棠中亦發(fā)現(xiàn)了含量較為豐富的根皮苷［6］。木姜葉柯及其變種多穗柯則是另一類根皮苷較為豐富的植物［7］。提取木姜葉柯中的總黃酮已有相關(guān)報(bào)道［8］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以熱水提取法獲得根皮苷，并以高效液相色譜法建立了其含量測(cè)定方法。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑 木姜葉柯，采集于羅浮山區(qū)，其原植物經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)彭光天博士及華南農(nóng)業(yè)大學(xué)李鎮(zhèn)魁副教授鑒定為殼斗科柯屬植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun. ，植物標(biāo)本存放于惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院；根皮苷（對(duì)照品，西安天瑞植物科技有限公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia試劑公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia試劑公司）；超純水為自制品。其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器 高效液相色譜系統(tǒng)：LC-20AT 二元溶劑輸送泵，SPD-20A紫外檢測(cè)器，日本島津制作所；KQ-3200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；AL204型精密電子天平，瑞士梅特勒－托利多公司。

2 結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 將木姜葉柯干燥葉片剪成碎片，稱取5.0 g，置500 mL圓底燒瓶中，按料液比1：20加入去離子水，回流提取1小時(shí)，趁熱抽濾。濾液濃縮，減壓干燥，得淺棕色粉末，稱重。精密稱取提取物20mg，加入100mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容。以移液管移取6ml，置50ml容量瓶中，以甲醇定容，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即為供試品溶液，備用。

2.2 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），瑞典Akzo Nobel公司。檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；流動(dòng)相：甲醇：水＝47：53。流速：1.0 mL/min。柱溫：32 ℃。進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，經(jīng)反復(fù)摸索，獲得主要色譜峰能分開且保留時(shí)間相對(duì)較短的色譜條件。以根皮苷對(duì)照品進(jìn)樣，可知其保留時(shí)間約5.5min，與其它成份之間無干擾（圖1）。

圖 1 根皮苷對(duì)照品 (a) 、及木姜葉柯水提取物 (b) 的高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取根皮苷12.8mg，以甲醇配制成根皮苷濃度為102.4 μg/mL、51.2 μg/mL、25.6 μg/mL、12.8 μg/mL、6.4μg/mL的系列對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品液，按2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根皮苷濃度與峰面積的線性關(guān)系為：A=50376C-5688.9，r=0.9998。

2.5 精密度試驗(yàn) 取濃度為25.6 μg/mL的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL。以根皮苷面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。其RSD為0.79% （表1）。

表1 HPLC測(cè)定根皮苷的精密度 (n=6)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取某一批次的樣品精密稱定，共計(jì)6份，依上述方法測(cè)定。測(cè)得熱水提取物的平均含量為93.12±1.76%，表明含量測(cè)定重復(fù)性良好（表2）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取精密度項(xiàng)下的供試品溶液在0、4、8、12、18、24 h的時(shí)間進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。雖然在12h后測(cè)得其含量略有下降，但在24 h內(nèi)其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.28%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定（表3） 。

表2 HPLC測(cè)定根皮苷的重復(fù)性 (n=6)

表3 HPLC測(cè)定根皮苷的方法穩(wěn)定性

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取0.1g熱水提取物，分別按照樣品含量的80%、100%和120%加入根皮苷對(duì)照品甲醇溶液，分別進(jìn)高效液相測(cè)量峰面積，計(jì)算加樣回收率。測(cè)得根皮苷的平均回收率為：98.83±0.94%（表4）。

表4 HPLC測(cè)定根皮苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 我們?nèi)崴崛》ǐ@得的三個(gè)不同批次的樣品按2.1項(xiàng)下“供試品溶液的制備”所述方法進(jìn)行測(cè)定。樣品測(cè)定結(jié)果見表5。結(jié)果表明以此法獲得的提取物，其根皮苷含量均在92%以上。因此，在提取木姜葉柯中的根皮苷時(shí)，熱水法為一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的方法。

表5 根皮苷熱水提取物樣品的含量測(cè)定結(jié)果 (n=5)

3 討論

木姜葉柯與同屬植物多穗柯均為殼斗科植物，后者為前者的變種［9］。根據(jù)第四次全國(guó)中藥資源普查廣東調(diào)查隊(duì)調(diào)查結(jié)果顯示，木姜葉柯在廣東境內(nèi)的平遠(yuǎn)縣泗水鎮(zhèn)等地偶見散生，在博羅縣羅浮山獨(dú)有成片分布（當(dāng)?shù)鼐用穹Q之為“羅浮甜茶”），其含有的二氫查耳酮苷類，是除蔗糖等還原糖之外的非糖類天然甜味成份。本實(shí)驗(yàn)為系統(tǒng)開發(fā)甜茶的基礎(chǔ)研究，旨在建立木姜葉柯中根皮苷的含量測(cè)定方法，為后期深入開發(fā)提供必要的基礎(chǔ)。

木姜葉柯水提取物用微孔濾膜直接過濾即可在高效液相色譜儀上進(jìn)行測(cè)定。此法可用于對(duì)樣品提取進(jìn)行中間監(jiān)測(cè)。但考慮到根皮苷在熱水與冷水中的溶解度相差較大，我們前期實(shí)驗(yàn)中考慮獲得提取物固體后用甲醇溶解后進(jìn)樣，效果不錯(cuò)。因此我們最終選擇用甲醇作溶劑。

根皮苷的吸收峰主要在286nm左右，與其苷元根皮素的吸收峰基本相同［10］。因熱水提取物中主要的雜質(zhì)為根皮素，因此選擇286nm為波長(zhǎng)亦可相對(duì)粗略地了解提取物中根皮苷和根皮素的比例。根皮苷是一種二氫查耳酮的苷類，極性相對(duì)較大。曾參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行色譜條件摸索［11，12］，發(fā)現(xiàn)其中極性較大的微小雜質(zhì)成份干擾色譜圖。通過摸索，最終確定以甲醇：水（47：53）為色譜條件。在此條件下，根皮苷能與其它成份分開，且相對(duì)來說保留時(shí)間較短，可節(jié)約分析時(shí)間。有文獻(xiàn)報(bào)道以醋酸或其它酸性物質(zhì)加入流動(dòng)相中改善峰形。我們研究發(fā)現(xiàn)，不加醋酸峰形影響不大。為減少加入醋酸后色譜柱沖洗所耗時(shí)間，我們選擇甲醇／水系統(tǒng)作為流動(dòng)相。在摸索階段我們?cè)鴩L試采用不同的柱溫進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)柱溫在30℃～35℃之間保留時(shí)間較為理想。增加柱根皮苷保留時(shí)間略有提前，減少柱溫保留時(shí)間略有推后。最終我們確定以柱溫為32℃進(jìn)行測(cè)定。

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Assay of phlorizin from the water extract of Lithocarpus litseifolius by high performance liquid chromatography

Wen Chen1, Mingyue Du2, Haoran Liu2
(1. Huizhou Health Sciences Polytechnic, Huizhou 516025, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hu’nan University, Changsha 410082, China)

Objective To establish a method for the determination of phlorhizin from the extract of Lithocarpus litseifolius by high pressure liquid chromatography (HPLC). Methods Lithocarpus litseifolius was extracted by hot water, and the phlorhizin was determined by HPLC. Chromatographic condition: Kromosi-C18 column, ultraviolet detector, wavelength 286 nm, mobile phase: methanol water (47:53), flow rate: 1.0 mL/min, sample volume: 20 μL; Column temperature: 32℃. Results The phlorhizin concentration ranged between 6.4～102.4 μg/mL showed good linear（r=0.9998）, and the average recovery was 98.83 ±0.94%. Conclusion The method is suitable for the quality control of phlorhizin in Lithocarpus litseifolius with good specificity and recovery.

lithocarpus litseifolius; phlorhizin ; high performance liquid chromatography

R284

A

1673-016X（2017）02-0190-03

2017-01-13

惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目 (2014B04000 004)

劉浩然，E-mail:295423884@qq.com