王文君 呂娜 尹銳 馬吉?jiǎng)佟±顣赞薄⌒旌枕n 張晶
摘要:金屬硫蛋白(MT)是一類(lèi)富含巰基、具有金屬結(jié)合特性的低分子量蛋白質(zhì),廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi),在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。就金屬硫蛋白的來(lái)源、生理功能、檢測(cè)方法、應(yīng)用前景進(jìn)行綜述,為后繼的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。
關(guān)鍵詞:金屬硫蛋白;來(lái)源;生理功能;應(yīng)用
中圖分類(lèi)號(hào):Q51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1002—1302(2016)01—0013—03
金屬硫蛋白(metallothionein,簡(jiǎn)稱(chēng)MT)是分子量介于2~8 ku之間的存在于動(dòng)物、微生物、植物中的一類(lèi)低分子量蛋白,其中半胱氨酸占總含量的20%~30%,富含金屬(Ag、Au、Bi、Cd、Hg、Zn、Cu等),并極少含有組氨酸和芳香族氨基酸的蛋白質(zhì)。金屬硫蛋白最早是Margashes和Vallee于1957年在馬腎中發(fā)現(xiàn)的。研究結(jié)果表明,金屬硫蛋白廣泛存在于各種微生物,高等動(dòng)、植物和人類(lèi)的各種組織、器官。但是目前尚未從禽類(lèi)動(dòng)物中分離得到金屬硫蛋白。1975年P(guān)rinz首次從釀酒酵母中分離得到Cu-MT,因其基本結(jié)構(gòu)、特性和功能與哺乳動(dòng)物MT類(lèi)似而成為類(lèi)金屬硫蛋白。1977年科學(xué)家又首次從大豆的根中分離出富含Cd2+的復(fù)合物,由于它在功能、性質(zhì)以及柱層析上的表觀分子量與動(dòng)物體內(nèi)金屬硫蛋白十分相似,故將其稱(chēng)為類(lèi)金屬硫蛋白。第2屆金屬硫蛋白國(guó)際會(huì)議對(duì)金屬硫蛋白的具體定義作出了明確規(guī)定,將以前稱(chēng)之為類(lèi)金屬硫蛋白的蛋白質(zhì)和動(dòng)物產(chǎn)金屬硫蛋白統(tǒng)稱(chēng)為金屬硫蛋白。
1金屬硫蛋白的來(lái)源及制備方法
1.1動(dòng)物來(lái)源金屬硫蛋白
由于哺乳動(dòng)物源的金屬硫蛋白與人的金屬硫蛋白無(wú)論是結(jié)構(gòu)、活性還是功能都很相似,因此在實(shí)際生產(chǎn)中,主要用鎘或鋅等金屬誘兔、老鼠等動(dòng)物肝臟合成,經(jīng)過(guò)分離純化得到純品MT。隨著研究逐步深入,發(fā)現(xiàn)環(huán)毛蚓、兩棲類(lèi)動(dòng)物大鯢等,都可誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬硫蛋白。環(huán)毛蚓具有富集重金屬及抗重金屬的性質(zhì),還具有蛋白質(zhì)含量高、易飼養(yǎng)、價(jià)格低廉的特點(diǎn),是生產(chǎn)制備MT較廉價(jià)的方法。李華利用金屬離子能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬硫蛋白性質(zhì),將鯉魚(yú)置于Cd2+溶液中,以誘導(dǎo)鎘-金屬硫蛋白的合成,通過(guò)分析,經(jīng)誘導(dǎo)鯉魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生的金屬硫蛋白性質(zhì)與哺乳動(dòng)物產(chǎn)金屬硫蛋白性質(zhì)相似。
1.2植物來(lái)源金屬硫蛋白
徐振彪等摸索了一種用于玉米金屬硫蛋白的提取方法:以玉米幼苗葉片為材料,成功提取了玉米金屬硫蛋白的粗提液,該溶液在290 nm處有特征吸收峰,且經(jīng)過(guò)脫金屬處理后其290 nm處特征吸收峰明顯降低,通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè),在分子量14 ku附近有1個(gè)單條帶,提示粗提液中含有金屬硫蛋白。這為植物金屬硫蛋白的研究奠定了基礎(chǔ)。
1.3微生物來(lái)源金屬硫蛋白
對(duì)微生物的研究結(jié)果表明,加入金屬離子可以使菌體內(nèi)大量合成并且積累金屬硫蛋白。和使用動(dòng)物肝臟提取金屬硫蛋白的方法相比,利用微生物制備金屬硫蛋白具有簡(jiǎn)便、過(guò)程可控、生產(chǎn)條件要求低等優(yōu)點(diǎn)。朱麗梅等用2.0 mmol/LCuCl2對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行誘導(dǎo)使之產(chǎn)生金屬硫蛋白,并測(cè)定金屬硫蛋白對(duì)羥自由基和氧自由基的清除率及對(duì)動(dòng)物體的安全性。研究結(jié)果顯示,該金屬硫蛋白對(duì)羥自由基和氧自由基清除率分別達(dá)到了91.75%和83%,并且此法誘導(dǎo)合成的金屬硫蛋白安全無(wú)毒副作用。王巍等以基因改良過(guò)的九州蟲(chóng)草真菌為菌種,采用液態(tài)深層發(fā)酵增殖菌絲體并用ZnSO4刺激誘導(dǎo)其合成金屬硫蛋白,產(chǎn)率可達(dá)10.86 mg/g(菌絲體濕重),相較目前的傳統(tǒng)方法產(chǎn)率提高了0.1萬(wàn)~1萬(wàn)倍。成玉梁以?xún)?yōu)良突變株釀酒酵母N′-1為研究對(duì)象,通過(guò)優(yōu)化最終確定了最佳條件,即選擇CuCl2作為誘導(dǎo)試劑,濃度110 mmol/L,活化培養(yǎng)時(shí)間48 h,誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間48 h,接種量1 mL/50 mL培養(yǎng)液,誘導(dǎo)培養(yǎng)基裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,搖床轉(zhuǎn)速40 r/min。按照以上培養(yǎng)條件安排試驗(yàn),測(cè)得金屬硫蛋白產(chǎn)量(以巰基活性計(jì))較之前的試驗(yàn)有了大幅提高。張琪等探討鋅離子脅迫下蛹蟲(chóng)草(Cordyceps milita-ris)金屬硫蛋白的產(chǎn)生及性質(zhì),蛹蟲(chóng)草菌絲體以15 g/L Zn2+在10 L發(fā)酵罐中誘導(dǎo)培養(yǎng)56 h后收集,產(chǎn)率為1 L發(fā)酵液收集12.021 g菌絲體(干質(zhì)量),發(fā)酵終點(diǎn)處金屬硫蛋白含量為12.876 mg/g菌絲體(濕重),菌絲體經(jīng)提取、分離、純化,凍干得到蛹蟲(chóng)草金屬硫蛋白純品。有學(xué)者通過(guò)鋅誘導(dǎo)小球藻分離出金屬硫蛋白,證實(shí)小球藻通過(guò)誘導(dǎo)的方法來(lái)產(chǎn)生金屬硫蛋白,為金屬硫蛋白的生產(chǎn)研究提供新的探索。
2金屬硫蛋白的生物學(xué)功能
2.1金屬硫蛋白對(duì)重金屬的解毒和調(diào)節(jié)作用
金屬硫蛋白的1個(gè)主要生理功能是參與生物體內(nèi)必需金屬元素的調(diào)節(jié)和非必需金屬元素的解毒。在利用金屬硫蛋白基因敲除小鼠和普通野生對(duì)照小鼠研究金屬硫蛋白保護(hù)小鼠胎兒免受鎘毒作用的試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白基因敲除小鼠的胎盤(pán)中鎘含量明顯高于野生對(duì)照鼠,原因是對(duì)照鼠懷孕期間肝臟金屬硫蛋白含量較高,降低了體內(nèi)鎘的運(yùn)輸。對(duì)貝類(lèi)的研究結(jié)果表明,其體內(nèi)Cd的積累與金屬硫蛋白有關(guān)。陸生蝸牛能忍受高濃度的Cd和Cu,是因?yàn)槠渲心c腺中金屬硫蛋白具有對(duì)Cd解毒功能,同時(shí)外套膜金屬硫蛋白具有cu調(diào)節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn),甲殼動(dòng)物貝類(lèi)動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)的體內(nèi)重金屬含量也很高,試驗(yàn)也證實(shí)了貝類(lèi)動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)動(dòng)物的金屬硫蛋白存在解毒作用。
金屬硫蛋白的解毒和調(diào)節(jié)作用是有限的,重金屬元素含量超過(guò)個(gè)閾值,該種動(dòng)物就會(huì)出現(xiàn)病理狀態(tài),嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致種群的衰退甚至滅絕。耐污群是在生存環(huán)境受某種特別污染物污染后,動(dòng)物本身經(jīng)過(guò)一系列免疫調(diào)節(jié)之后重新適應(yīng)的種群。在污染生存環(huán)境下,尤其是重金屬污染,耐污小種群與敏感種群的生理生態(tài)功能方面肯定具有明顯差異。但目前對(duì)耐污小種群的金屬硫蛋白基因的擴(kuò)增、個(gè)體適合度的降低、細(xì)胞功能的受損、生殖力降低等方面是否與其金屬硫蛋白的解毒和調(diào)節(jié)作用有關(guān),還有待進(jìn)一步深入研究。
2.2金屬硫蛋白參與細(xì)胞調(diào)節(jié)
金屬硫蛋白的含量隨物種和發(fā)育進(jìn)程的差異有所變化。大鼠、小鼠和兔等在胎兒期和剛出生時(shí),肝臟中的金屬硫蛋白含量是最高的;而人、羊和豚鼠等在懷孕的中期或晚期金屬硫蛋白達(dá)到最大值。同時(shí),金屬硫蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位也與發(fā)育進(jìn)程有關(guān)。在胎鼠和新生鼠的肝細(xì)胞核中,金屬硫蛋白含量高,隨后逐漸降低,2周后,金屬硫蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。金屬硫蛋白核定位的作用可能與金屬在細(xì)胞周期中與各種細(xì)胞核成分的相互作用有關(guān)。與金屬硫蛋白結(jié)合的金屬也能結(jié)合組蛋白、核RNA和核酸性蛋白,從而參與對(duì)機(jī)體發(fā)育進(jìn)程的調(diào)節(jié)。金屬硫蛋白的核定位現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)也是認(rèn)識(shí)金屬硫蛋白與細(xì)胞分化相關(guān)的一個(gè)重要基礎(chǔ)。在腫瘤組織中,分化程度越小則細(xì)胞核中金屬硫蛋白含量越高,金屬硫蛋白調(diào)控細(xì)胞分化主要與金屬硫蛋白結(jié)合金屬,特別是和鋅有關(guān),金屬硫蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)自由鋅水平而影響基因表達(dá)。
2.3金屬硫蛋白對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)
金屬硫蛋白對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的主要作用是提高極端生理刺激下生物體的存活率。金屬硫蛋白也被確定為一種阻止細(xì)胞凋亡的因子及一種重金屬螯合劑。目前,金屬硫蛋白的種類(lèi)主要有MT-1、MT-2、MT-3和MT-4,可能還會(huì)有新的不斷被發(fā)現(xiàn)。而且不同類(lèi)型的金屬與ApoMT以不同形式結(jié)合引起的影響更增加了復(fù)雜性。在考慮金屬硫蛋白在疾病中的可能作用及金屬硫蛋白對(duì)氧自由基團(tuán)、線(xiàn)粒體及神經(jīng)的作用時(shí),可得出如下結(jié)論,高金屬硫蛋白(MT)含量可能介入疾病發(fā)生過(guò)程。Arndt-Shultz法則指出低濃度有害因子通常是激活生物過(guò)程而非抑制它們,那么金屬硫蛋白(MT)的作用就是在低濃度的金屬硫蛋白下可以協(xié)作提高鈣對(duì)ADP啟動(dòng)的氧消耗的抑制作用。在無(wú)刺激的狀態(tài)下金屬硫蛋白的作用可能為提高鈣流量,低濃度的金屬硫蛋白可能在調(diào)節(jié)自由基水平上發(fā)揮作用。
2.4金屬硫蛋白的防輻射作用
金屬硫蛋白是誘導(dǎo)蛋白,能被多種因素誘導(dǎo)生成。無(wú)論是自然產(chǎn)生的還是誘導(dǎo)生成的金屬硫蛋白氨基酸組成基本相同。輻照的直接和間接作用引起機(jī)體損傷的另一個(gè)重要方面是使機(jī)體蛋白質(zhì),特別是酶受到損壞。機(jī)體受到輻照后啟動(dòng)了內(nèi)源金屬硫蛋白同化代謝。金屬硫蛋白含有大量巰基和低能空軌道,能有效清除多種自由基,使輻照的間接作用對(duì)機(jī)體的損傷大為減少。金屬硫蛋白中的親電巰基基團(tuán)可以通過(guò)氫供體使受損的DNA得以修復(fù)。輻照引起的DNA損傷和羥自由基有關(guān),而金屬硫蛋白是一種有效的羥自由基清除劑。金屬硫蛋白抗輻照影響作用的明確機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
2.5金屬硫蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)
很多因素可影響腦內(nèi)金屬硫蛋白的表達(dá)。一些重金屬離子如Cu2+、Zn2+,以及糖皮質(zhì)激素和兒茶酚胺能夠調(diào)控腦內(nèi)MT-1和MT-2的水平,但是這些因素都不能調(diào)節(jié)MT-3的水平,說(shuō)明MT-3與MT-1、MT-2有不同的調(diào)節(jié)特點(diǎn)。在表達(dá)IL-6的轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)其小腦、腦干、下丘腦等腦組織中MT-1和MT-2含量明顯增加,說(shuō)明腦內(nèi)MT-1和MT-2的表達(dá)增加和小鼠炎癥有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明腦內(nèi)MT-1的增加能夠降低MT-3的含量,這種現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是由于Zn2+在腦中局限性集中,繼而引發(fā)MT-3在腦內(nèi)分布發(fā)生改變。此外,研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)金屬硫蛋白含量與年齡及性激素水平有密切關(guān)系,MT-1和MT-3 mRNA含量在3月齡小鼠腦中增加,在6月齡小鼠腦中減少;在試驗(yàn)中觀察到,過(guò)度表達(dá)MT-1的雄性小鼠,其腦內(nèi)金屬硫蛋白增加集中在小腦,而雌性小鼠各腦區(qū)金屬硫蛋白含量均增多,說(shuō)明性激素對(duì)MT mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)及金屬硫蛋白表達(dá)有潛在調(diào)節(jié)作用。
3金屬硫蛋白的檢測(cè)方法
3.1 Cd/血紅蛋白親和分析法
Cd/血紅蛋白親和分析法是測(cè)定生物樣本中金屬硫蛋白含量的一種快速、靈敏、特異的方法,能對(duì)大多數(shù)生物樣品中的MT進(jìn)行準(zhǔn)確快速的評(píng)估,檢測(cè)時(shí)間短、成本低,有利于大量研究。
3.2銀染法
電泳與銀染的結(jié)合可作為檢測(cè)各種組織和培養(yǎng)細(xì)胞中MT的靈敏方法。這種超敏感方法可用于Cd中毒小鼠肝臟提取物和其他來(lái)自體外培養(yǎng)細(xì)胞提取物中MT的檢測(cè),而且該法較經(jīng)濟(jì),不需要放射性同位素。
3.3液相色譜法
利用HPLC法將Cd誘導(dǎo)大鼠肝臟中的MT分離出來(lái),直接聯(lián)于AAS后,檢測(cè)樣品中金屬含量,達(dá)到對(duì)MT定量檢測(cè)的目的,該方法具有方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),還可利用HPLC分離MT,再根據(jù)樣品對(duì)波長(zhǎng)150 nm紫外光吸收特性來(lái)直接對(duì)MT定量。
3.4共振光散射法
通過(guò)調(diào)節(jié)激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)相等,可獲得待測(cè)組分所引起的共振光散射強(qiáng)度。共振光散射強(qiáng)度與共振光散射粒子的濃度在一定范圍內(nèi)有線(xiàn)性關(guān)系,據(jù)此可直接進(jìn)行定量分析。薛金花等利用該方法檢測(cè)了MT的含量,檢出限為19.05 ng/mL,該方法靈敏、簡(jiǎn)便、選擇性好。
3.5競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附分析
ELISA的檢測(cè)限為0.5 pg/孔,與用單克隆抗體的RIA和ELISA的檢測(cè)限60 pg/孔相比更靈敏。因此能替代RIA和單克隆ELISA,不僅能用于確定生物材料中基礎(chǔ)MTs水平,而且能研究MTs濃度的微小偏差。
3.6毛細(xì)管電泳
許多類(lèi)型毛細(xì)管具有分析時(shí)間快(通常<15 min),樣本消耗非常小(低于nL),易于實(shí)現(xiàn)分析自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),能用來(lái)分離結(jié)構(gòu)非常相似的蛋白。但在應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)時(shí),必須仔細(xì)選擇最合適的分離條件和毛細(xì)管。
3.7偶聯(lián)技術(shù)
偶聯(lián)技術(shù)是快速靈敏、全面定性定量生物標(biāo)本中MT亞型的一種最具吸引力的工具,未來(lái)能有效代替金屬飽合分析、免疫分析而進(jìn)人生化和臨床實(shí)驗(yàn)室。金屬硫蛋白在生物界中存在的廣泛性、生物作用的多樣性決定了對(duì)其精確定量的必要性。
4金屬硫蛋白的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景
4.1金屬硫蛋白在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用
金屬硫蛋白在治療癌癥、血管疾病、重金屬中毒及營(yíng)養(yǎng)缺乏癥等方面都有很大功效。金屬硫蛋白能有效減輕放射療法的副作用,在放療過(guò)程中可保證正常細(xì)胞不受侵害,Tsu-tomu發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白具有抑制胃潰瘍形成的作用。目前,盡管金屬硫蛋白的抗病作用已經(jīng)被多次證明,包括能夠阻止脂質(zhì)過(guò)氧化,增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的功能性,對(duì)輻射及光損傷有強(qiáng)烈的抵抗作用,提高免疫力,促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝等等功能,這些功能都可以由金屬硫蛋白極強(qiáng)的抗自由基反應(yīng)解釋?zhuān)瞧渥饔脵C(jī)理并沒(méi)有被完全揭開(kāi)。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外的臨床試驗(yàn)證明,金屬硫蛋白對(duì)多種頑固癥、慢性病、老年病,如糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化、尿毒癥、老年癡呆有很強(qiáng)的療效。可以預(yù)料未來(lái)金屬硫蛋白在臨床醫(yī)學(xué)上將會(huì)被大量推廣應(yīng)用。
4.2金屬硫蛋白在美容、護(hù)膚品行業(yè)中的應(yīng)用
因?yàn)榻饘倭虻鞍拙哂袕?qiáng)烈的抗自由基功能,所以其在美容和護(hù)膚品行業(yè)中具有極為廣泛的應(yīng)用前景,前些年,國(guó)內(nèi)刮過(guò)一股化妝品添加SOD的流行風(fēng),SOD作為一種抗自由基的藥物,相對(duì)于MT,只能清除O2-而不能清除·OH,且MT的抗氧化效果是SOD的數(shù)倍,分子量也僅為SOD的1/6,更利于皮膚的吸收。在小鼠的毒理學(xué)試驗(yàn)、家兔的多次皮膚刺激試驗(yàn)以及北京市疾病預(yù)防控制中心所做的人體貼斑試驗(yàn)均表明,MT在皮膚表面應(yīng)用時(shí)為弱致敏原,無(wú)潛在致敏原。所以在可以預(yù)見(jiàn)的將來(lái),MT完全可以作為比SOD更強(qiáng)的抗衰老添加劑添加在化妝品中。
4.3金屬硫蛋白在保健品行業(yè)中的應(yīng)用
當(dāng)前社會(huì)人口老齡化嚴(yán)重,老年人越來(lái)越多,我國(guó)堅(jiān)持計(jì)劃生育的國(guó)策,同時(shí)由于傳統(tǒng)文化的關(guān)系人們有強(qiáng)烈的尊老愛(ài)幼情緒,故而針對(duì)老年人和孩子的營(yíng)養(yǎng)保健品需求極大,致使我國(guó)保健品行業(yè)快速而蓬勃地發(fā)展起來(lái)。金屬硫蛋白具有強(qiáng)烈的抗衰老功效以及制劑方便等特點(diǎn),可制成粉劑添加到麥乳精或奶粉中,也可以制成片劑含服或制成抗衰老功能飲液,添加方便且不影響口味。隨著人們保健意識(shí)的逐步提高,金屬硫蛋白保健品將逐漸遍及中國(guó)大部分家庭,僅以口服液為例,金屬硫蛋白在國(guó)內(nèi)保健品市場(chǎng)上甚至要比化妝品市場(chǎng)的前景更為廣闊。
4.4金屬硫蛋白在重金屬檢測(cè)與生物體生長(zhǎng)環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用
研究結(jié)果表明,生物體接觸環(huán)境中的重金屬含量和生物體體內(nèi)的金屬硫蛋白含量密切相關(guān)。但是金屬硫蛋白在生物體體內(nèi)的含量又不僅僅與環(huán)境中的重金屬含量有關(guān),還與其他物理環(huán)境(如溫度、濕度)以及饑餓等相關(guān),所以現(xiàn)在的研究水平還不好以生物體內(nèi)的金屬硫蛋白含量來(lái)斷定環(huán)境中的重金屬含量,但是在未來(lái),經(jīng)過(guò)深入研究生物體內(nèi)金屬硫蛋白濃度和生物體生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)系,金屬硫蛋白必定可以應(yīng)用于重金屬中毒與環(huán)境監(jiān)測(cè)中。