微波協(xié)同復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖工藝研究

周小偉，陳勇輝，葉若松，熊艷，劉惠欣，葉曉瑜，鐘瑞敏，*

（1.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005；2.江西生物科技職業(yè)學(xué)院，江西南昌330200；3.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330013；4.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西南昌330200）

微波協(xié)同復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖工藝研究

周小偉1，陳勇輝2，葉若松3，熊艷4，劉惠欣1，葉曉瑜1，鐘瑞敏1，*

（1.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005；2.江西生物科技職業(yè)學(xué)院，江西南昌330200；3.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330013；4.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西南昌330200）

以猴頭菇子實體為原料，研究微波協(xié)同復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖的工藝，并將復(fù)合酶法與微波協(xié)同復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖的得率進(jìn)行對比。微波協(xié)同復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖的最佳工藝條件為酶添加量2.0%，酶解pH4.5，酶解時間150 min，酶解溫度50℃，微波功率119 W，料液比1∶15（g/mL），微波時間150 s，該條件下猴頭菇多糖提取率達(dá)到19.13%。

猴頭菇；多糖；復(fù)合酶；微波酶法

猴頭菇又名猴頭蘑、猴頭菌等，是著名的藥食兩用菌，因其子實體形狀神似猴子頭部而得名。猴頭菌中最主要的活性物質(zhì)即為猴頭菇多糖，它是生命有機(jī)體內(nèi)非常重要的組成部分。猴頭菇多糖不僅具有合成高分子所不具備的特殊生物活性，還具有各種各樣的生物學(xué)功能[1]。研究表明，猴頭菇多糖具有降低血脂、防止衰老、抑制腫瘤、提高免疫力等特殊生理功能，可普遍應(yīng)用在醫(yī)藥范疇及保健食品領(lǐng)域。

目前報道的對猴頭菇多糖提取的方法主要有熱水浸提法[2-4]、酶法[5-6]、超聲波提取法[7-8]、超聲酶法[9]等。但是熱水浸提法所需時間較長，提取率較低。近年來，酶制劑由于其獨特的安全性及高效性，越來越多的被應(yīng)用于食用菌的功能活性提取方面。本文以猴頭菇為原料，采用微波協(xié)同復(fù)合酶，利用正交試驗方法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并和復(fù)合酶提取多糖對比，分析兩種方法對于猴頭菇多糖得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干猴頭菇：購自韶關(guān)五馬寨菌業(yè)有限公司；葡萄糖、蒸餾水、無水乙醇、苯酚、氯仿、正丁醇、濃硫酸、檸檬酸、檸檬酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純；纖維素酶（100 000 U/g）和果膠酶（100 000 U/g）為食品級。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器與設(shè)備見表1。

表1 儀器與設(shè)備Table 1 Instruments and equipments

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將猴頭菇子實體切成小塊，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在60℃條件下干燥24 h，至恒重后放入高速粉碎機(jī)中粉碎，過30目篩，備用。

1.3.2 提取方法

猴頭菇粉→精確稱重→加復(fù)合酶—纖維素酶/果膠酶=1∶1（質(zhì)量比）→按料液比1∶15（g/mL）加入一定量蒸餾水→過濾→乙醇沉淀→復(fù)溶→除蛋白→醇沉→冷凍干燥→猴頭菇多糖→測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖1.25 g定容至250 mL，再從中吸取5 mL樣液至250 mL的容量瓶，稀釋至刻度，配得濃度為100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖樣液。往5支試管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)樣液，再向試管依次加入蒸餾水，使最終體積均為1 mL。另取蒸餾水1 mL作空白試驗。用移液管向每支試管各加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液，搖晃至均勻；緊接著向每支試管內(nèi)用移液管緩慢加入5 mL濃硫酸，搖勻待測樣品，溫度冷卻至室溫[4]。

在490 nm下，測定不同質(zhì)量濃度葡萄糖樣品的吸光度。最后，以所測樣品吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]，如圖1所示。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程：y=0.998 6x+0.081 4，R2=0.998 8。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

1.3.4 猴頭菇多糖含量測定

以苯酚-硫酸法測定猴頭菇多糖含量[10]，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。猴頭菇多糖的得率以式（1）表示。

式中：W為猴頭菇多糖提取率，%；Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線所得多糖濃度，mg/mL；n為猴頭菇多糖溶液的稀釋倍數(shù)；V為樣品的體積，mL；m為原料質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果分析

2.1 復(fù)合酶法

2.1.1 酶添加量對猴頭菇多糖提取率的影響

不同酶添加量對猴頭菇多糖提取率的影響見圖2。

圖2 復(fù)合酶添加量對多糖提取率的影響Fig.2 The effect of the amount of combined-enzyme on the yield of polysaccharide

由圖2可知，隨著酶添加量的增多，猴頭菇多糖的得率呈不斷上升的趨勢，當(dāng)酶添加量為2%時，猴頭菇多糖得率最高。之后得率呈略微下降趨勢，這是因為猴頭菇的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)主要為纖維素和果膠，當(dāng)纖維素酶和果膠酶含量適當(dāng)時，能夠裂解纖維素和果膠，反之，當(dāng)酶添加量過多時，溶質(zhì)和溶劑比值也相應(yīng)升高，從而降低酶解效果。

2.1.2 酶解時間對猴頭菇多糖提取率的影響

酶解時間對猴頭菇多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解時間對多糖提取率的影響Fig.3 The effect of enzymolysis time on the yield of polysaccharide

從圖3可知，猴頭菇多糖得率隨著酶解時間的延長不斷增加，當(dāng)酶解時間達(dá)到120 min時，可以達(dá)到14%的得率，但是隨著酶解時間繼續(xù)延長，猴頭菇多糖的得率沒有得到多少提高，這是因為酶解所需的酶消耗的原因。

2.1.3 酶解pH值對猴頭菇多糖提取率的影響

在設(shè)定復(fù)合酶添加量2%，酶解溫度50℃，酶解時間90 min的前提下，探究不同的酶解pH值對猴頭菇多糖提取率的影響，試驗結(jié)果見圖4。

圖4 酶解pH對多糖提取率的影響Fig.4 The effect of pH value on the yield of polysaccharide

由圖4可知，當(dāng)溶液pH值為4時，酶解效果最好，得到的猴頭菇多糖得率也最高，pH值過低或過高均對酶解效果產(chǎn)生不利影響。這充分說明復(fù)合酶的最佳酶活pH條件為4。

2.1.4 酶解溫度對猴頭菇多糖提取率的影響

在設(shè)定復(fù)合酶添加量2%，復(fù)合酶酶解pH 4.0，酶解時間90 min的前提下[11]，探究不同的酶解溫度對猴頭菇多糖提取率的影響，試驗結(jié)果見圖5。

由圖5可知，45℃為復(fù)合酶的最適作用溫度，此時猴頭菇的多糖提取率達(dá)最大值。當(dāng)酶解溫度低于45℃，復(fù)合酶的活性會受到抑制，致使猴頭菇多糖的提取率偏低；隨著酶解溫度的升高，復(fù)合酶又容易受熱發(fā)生變性，從而降低酶活，導(dǎo)致多糖的提取率也偏低。因此，當(dāng)酶解溫度在45℃～60℃的范圍內(nèi)時，溫度越高，猴頭菇多糖提取率越低。試驗確定40℃～50℃為復(fù)合酶適宜的酶解溫度。

圖5 酶解溫度對多糖提取率的影響Fig.5 The effect of enzymolysis temperature on the yield of polysaccharide

2.1.5 正交試驗

在復(fù)合酶法單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，優(yōu)化復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖的工藝，從而確定最佳提取工藝參數(shù)，并且考察各因素對猴頭菇多糖提取率影響的主次順序。選擇對多糖得率影響較大的4個因素（酶添加量、酶解時間、酶解pH值、酶解溫度）設(shè)計L9（34）的正交試驗，所有試驗均重復(fù)3次，所測多糖得率取平均值。復(fù)合酶法正交試驗結(jié)果見表2。

表2 復(fù)合酶法正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of complex protease method

極差Rj分析表明，4個因素影響猴頭菇多糖提取率的主次關(guān)系為：酶解溫度（D）＞酶解時間（B）＞酶解pH值（C）＞酶添加量（A）。正交試驗結(jié)果顯示復(fù)合酶法最佳工藝條件為A2B3C3D3，在最佳工藝條件下進(jìn)行驗證試驗，測得猴頭菇多糖提取率為15.62%，高于正交試驗中的最大值。即此次正交試驗確定采用復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖的最佳工藝參數(shù)為酶添加量2.0%，酶解時間150 min，酶解pH4.5，酶解溫度50℃。

2.2 微波協(xié)同復(fù)合酶法

在復(fù)合酶添加量為2.0%（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為1∶1），酶解pH值為4.5，酶解溫度50℃條件下水浴酶解150 min，之后進(jìn)行微波協(xié)同復(fù)合酶法的單因素及正交試驗。

2.2.1 微波功率對猴頭菇多糖提取率的影響

微波功率對提取率影響見圖6。

圖6 微波功率對提取率的影響Fig.6 The effect of microwave power on the yield of polysaccharide

由圖6可知，當(dāng)微波功率在119 W～231 W范圍內(nèi)，猴頭菇多糖提取率隨著微波功率的增大而增大；當(dāng)微波功率為231 W時，多糖的提取率到達(dá)最大值；而后，多糖提取率隨著微波功率的繼續(xù)增大而降低。微波功率過大，容易使猴頭菇多糖發(fā)生降解，從而降低多糖提取率。試驗確定119 W～385 W為微波功率的考察范圍。

2.2.2 料液比對猴頭菇多糖提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖7。

圖7 料液比對多糖提取率的影響Fig.7 The effect of the ratio of raw materials to water on the yield of polysaccharide

由圖7可知，用蒸餾水作為提取猴頭菇多糖的溶劑，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時，猴頭菇多糖提取率最高。隨著增大溶劑用量，猴頭菇的多糖提取率呈降低趨勢。為了節(jié)約成本，試驗確定1∶15（g/mL）～1∶25（g/ mL）為料液比的考察范圍。

2.2.3 微波時間對猴頭菇多糖提取率的影響

微波時間對提取率影響見圖8。

圖8 微波時間對多糖提取率的影響Fig.8 The effect of the microwave time on the yield of polysaccharide

由圖8可知，當(dāng)微波時間在90 s～150 s范圍內(nèi)時，猴頭菇多糖提取率隨著微波時間的延長而升高；當(dāng)微波時間為150 s時，多糖提取率最高；而后，多糖提取率隨著微波時間的延長而下降。因此，確定微波時間的考察范圍為120 s～180 s。

2.2.4 正交試驗

微波協(xié)同復(fù)合酶正交試驗設(shè)計見表3。

表3 微波協(xié)同復(fù)合酶正交試驗設(shè)計Table 3 Orthogonal experiment design of microwave-enzyme synergistic

在微波協(xié)同復(fù)合酶法的單因素試驗基礎(chǔ)上，對微波功率、料液比、微波時間這3個因素開展正交試驗，從而確定最佳提取工藝參數(shù)，并考察各因素對猴頭菇多糖提取率影響的主次順序。所有試驗均重復(fù)3次，所測多糖得率取平均值微波協(xié)同復(fù)合酶法正交試驗結(jié)果見表4。

極差Rj分析表明，3個因素影響猴頭菇多糖提取率的主次關(guān)系為：料液比（B）＞微波時間（C）＞微波功率（A）。正交試驗結(jié)果顯示微波協(xié)同復(fù)合酶法最佳工藝條件為A1B1C2。即此次正交試驗確定了采用微波協(xié)同復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖的最佳工藝參數(shù)為微波功率119 W，料液比1∶15（g/mL），微波時間150 s。

表4 微波協(xié)同復(fù)合酶法正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment results of microwave-enzyme synergistic

2.2.5 驗證性試驗

為了考察工藝的穩(wěn)定性，按微波協(xié)同復(fù)合酶法的最佳工藝條件A1B1C2進(jìn)行重復(fù)性試驗3次，多糖平均提取率為19.13%，高于按正交試驗中的最高值19.08%。該工藝重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本試驗以猴頭菇子實體為原料，通過單因素試驗和正交試驗，對微波協(xié)同復(fù)合酶法和復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖得率進(jìn)行比較，確定了微波協(xié)同復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖最佳工藝條件。確定微波協(xié)同復(fù)合酶法的最佳工藝條件為：微波功率119 W，微波時間150 s，料液比1∶15（g/mL）。復(fù)合酶提取猴頭菇多糖的最佳工藝條件為：酶添加量2%，酶解時間150 min，酶解pH為4.5，酶解溫度50℃。影響復(fù)合酶提取猴頭菇多糖得率的因素大小依次為酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH值＞酶添加量。微波協(xié)同復(fù)合酶法最佳工藝條件下可得到19.13%的猴頭菇多糖得率，比單獨復(fù)合酶條件下所得多糖得率提高12.5%。復(fù)合酶法最佳工藝條件下可得到15.62%的猴頭菇多糖得率。

通過微波輔助，可以明顯加快猴頭菇子實體顆粒物質(zhì)的振動，同時，微波對猴頭菇浸提液的加熱和破壞細(xì)胞的雙重作用，促使猴頭菇多糖溶出效率更高。

該研究在實驗室條件下通過正交試驗設(shè)計為規(guī)模提取猴頭菇多糖提供了一定的支撐依據(jù)。但是關(guān)于微波對復(fù)合酶的影響及底物的復(fù)合作用機(jī)制仍缺乏認(rèn)知。

[1] 張素斌,黃勁崢.猴頭菇多糖提取方法的比較[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(4):233－237

[2] 吳志明,李公斌,辛秀蘭,等.猴頭菇多糖的提取工藝[J].食品研究與開發(fā),2011,32(7):36－38

[3]張樹海.猴頭菇多糖提取及純化的研究[J].食品研究與開發(fā), 2006,27(11):103－106

[4]梁華,李雪林,陸亞春.猴頭菇多糖提取工藝研究[J].食品與機(jī)械, 2006,22(1):35－38

[5]趙洪梅,孫君,謝春陽.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取猴頭菇多糖工藝的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(創(chuàng)新版),2011(11):73－77

[6] 胡斌杰,師兆忠.超聲法提取猴頭菇多糖最佳工藝優(yōu)化研究[J].化學(xué)世界,2009(9):557－560

[7]吳美媛,周英,何慧明,等.猴頭菇多糖復(fù)合酶法提取及重金屬去除工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2013,34(16):15－17

[8] 張帥,沈楚燕,董基.酶法提取猴頭菇多糖的研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,31(2):76－79

[9] Chen S,Chen H,Tian J,et al.Enzymolysis－ultrasonic assisted extraction,chemical characteristics and bioactivities of polysaccharides from corn silk[J].Carbohydrate polymers,2014,101:332－341

[10]Zhu C,Liu X.Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Pomegranate peel by response surface methodology[J]. Carbohydrate polymers,2013,92(2):1197－1202

[11]陳瑞平,陳瑞戰(zhàn),張敏,等.復(fù)合酶法提取大蒜多糖及其抗氧化活性研究[J].分子科學(xué)學(xué)報,2012,28(1):47－52

Study on Hericium erinaceus Polysaccharide Extraction by Combined-enzyme Assistant with Microwave

ZHOU Xiao-wei1，CHEN Yong-hui2，YE Ruo-song3，XIONG Yan4，LIU Hui-xin1，YE Xiao-yu1，ZHONG Rui-min1，*
（1.Yingdong College of Food Science and Technology，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China；2.Jiangxi Biotech Vocational College，Nanchang 330200，Jiangxi，China；3.School of Life Science，Jiangxi Science&Technology Normal University，Nanchang 330013，Jiangxi，China；4.Institute for Quality Safety and Standards of Agricultural Products，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang 330200，Jiangxi，China）

In order to achieve the promoted method of extracting Hericium erinaceus，combined-enzyme and microwave-enzymatic method was used in the technique of extracting polysaccharide from Hericium erinaceus. The results was revealed that the optimal extraction condition were：2.0%amount of enzyme，4.5 of pH value，150 min of enzymatic hydrolysis time；50℃of enzymatic hydrolysis temperature，119 W of microwave power，1∶15（g/mL）of material-liquid ratio and 150 s of microwave time，which the content of polysaccharide could reach 19.13%.

Hericium erinaceus；polysaccharide；combined-enzyme；microwave-enzymatic method

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.011

2016－09－04

廣東省公益研究與能力建設(shè)專項（2015A010107018）；韶關(guān)學(xué)院科研項目（SY2014KJ16）；韶關(guān)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（Sycxcy2016-007）

周小偉（1986—），男（漢），講師，在讀博士，研究方向：食品中天然活性成分開發(fā)及工藝研究。

*通信作者：鐘瑞敏，男，教授，博士，研究方向：食品中天然產(chǎn)物及工藝研究。