翟 威 宋偉杰 王 強 吳媛媛 羅建泉 王星麗 瞿 亮 萬印華

（1中國科學(xué)院過程工程研究所，北京100190；2杭州百山祖生物科技有限公司，杭州310052）

靈芝（Ganoderma lucidum）又稱林中靈、瓊珍，原產(chǎn)地為中國，在我國已有上千年的藥用歷史。靈芝中提取的靈芝多糖具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、保肝、抗腫瘤、抗衰老、提高機體的耐缺氧能力等藥用價值[1～2]?，F(xiàn)在工業(yè)上獲取靈芝多糖一般采用傳統(tǒng)的水提醇沉法[3]，水提醇沉法中初步獲得靈芝水提物的熱水浸提法具有操作溫度高，能源消耗大的缺點，而且高溫操作存在破壞多糖結(jié)構(gòu)的可能性，所以其它的提取方式逐漸成為靈芝多糖的研究熱點。周吳萍等[4]采用回流提取法將靈芝多糖的得率提高到1.75%，但是仍未規(guī)避高溫提取。鄭靜[5]等采用超聲波與纖維素酶結(jié)合的方法可將靈芝水提物中靈芝多糖含量提升到57.62%，但超聲波存在破壞多糖結(jié)構(gòu)的缺點。試驗采用酶解法完全取代熱水提取法，使提取過程在低溫下進行，并將低溫提取過程與高溫提取過程進行對比，采用單因素試驗與正交試驗結(jié)合的方法，確定靈芝酶解的最佳條件，為下一步酶解低溫提取靈芝多糖方法在工業(yè)上的應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試驗試劑 靈芝干燥實體，由杭州百山祖生物科技有限公司提供；木瓜蛋白酶（800 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）、果膠酶（30 000 U/g），由南寧龐博生物工程有限公司生產(chǎn)；苯酚，分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；葡萄糖，分析純，由西隴化工股份有限公司生產(chǎn)；硫酸，分析純，由北京化工廠生產(chǎn)；鹽酸，分析純，由北京化工廠生產(chǎn)；氫氧化鈉，分析純，由西隴化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要試驗儀器 FA2004電子天平，由上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；DGX-053B-1鼓風(fēng)干燥箱，由上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司生產(chǎn)；DC-I-15臺式封閉電爐，由天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)；HYG-A全溫搖瓶柜，由蘇州培英實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；S210pH計，由梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司生產(chǎn)；UV-9000S紫外可見分光光度計，由上海元析儀器有限公司生產(chǎn)；JJ-1增力電動攪拌器，由金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準曲線的繪制 將葡萄糖置于鼓風(fēng)干燥箱中于105℃下干燥2 h后取出置于干燥器中冷卻至室溫，精密稱取100 mg葡萄糖，定容至100 mL，配制為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準液。精密吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL葡萄糖標(biāo)準液，分別置于10 mL具塞比色管中，加水定容為1 mL，加入質(zhì)量分數(shù)為6%的新配置苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，室溫避光靜置30 min，以1 mL超純水按照同樣操作作為空白對照，于490 nm測定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x/mg/mL），A490nm為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準曲線，得到回歸方程y=10.57x-0.001，r=0.994。

1.2.2 熱水提取法提取靈芝多糖 將靈芝子實體清洗烘干后粉碎，精密稱取靈芝子實體粉末20 g，加入400 mL水，加熱至沸騰，之后攪拌加熱3 h，期間保持液面不變，過濾后收集濾渣同條件再提取一次。合并兩次所得提取液，采用硫酸苯酚法測量所得靈芝水提物中靈芝多糖含量[6]。

1.2.3 酶法提取靈芝多糖[7-8]精確稱取靈芝子實體粉末5 g，加入250 mL錐形瓶中，加入100 mL水，根據(jù)設(shè)定條件調(diào)節(jié)pH并加入酶。置于搖瓶柜中，在150 r/min條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾收集提取液，并采用硫酸苯酚法測量所得靈芝水提物中靈芝多糖含量。如需二次提取，則過濾后收集濾渣同條件再提取一次，合并所得提取液，采用硫酸苯酚法測量所得靈芝水提物中多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一酶提取過程活性酶的加入可以有效地提高植物性天然產(chǎn)品的提取效果，其中作為活性酶的纖維素酶可將植物細胞壁的纖維素水解成水溶性糖，經(jīng)纖維素酶處理后的植物細胞壁水解破裂，利于胞內(nèi)活性成分化合物的溶出；果膠酶可以使細胞間的果膠質(zhì)降解，把細胞從組織內(nèi)分離出來；木瓜蛋白酶可以分解蛋白質(zhì)，因此試驗中選擇了纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶三種酶作為考察對象?？紤]提取次數(shù)是影響提取過程的重要因素，首先對單一酶的提取過程進行了考察，并與熱水提取法進行對比。以料液比1∶20，加酶量0.6%，不調(diào)節(jié)pH（原始pH），反應(yīng)溫度50℃，搖瓶柜速度150 r/min，提取時間3 h為條件，分別進行木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的酶解低溫提取過程，提取次數(shù)分別為一次和兩次，結(jié)果見圖1。從圖1中的一次提取過程的提取效果看出，三種酶輔助的一次提取效果遠低于熱水提取法，這說明當(dāng)提取液中的多糖濃度達到一定濃度的時候，多糖從靈芝子實體中的擴散受到抑制，此時需要更換新鮮提取液才能得到較高的多糖得率，即提高提取次數(shù)。從圖1中二次提取的效果看，采用二次酶解提取法可以使酶解提取的效果大大提高，提取效果接近熱水提取法，這說明采用二次酶解提取過程有可能獲得高于常規(guī)熱水提取過程的收率，而且可以實現(xiàn)在全低溫下提取。

2.2 復(fù)合酶提取過程為進一步提高酶解過程的效果，按照1∶1和1∶1∶1的比例，配制了木瓜蛋白酶+纖維素酶，纖維素酶+果膠酶，木瓜蛋白酶+果膠酶，木瓜蛋白酶+纖維素酶+果膠酶四種復(fù)合酶，根據(jù)單一酶的最適pH選定復(fù)合酶的提取pH（表1），使復(fù)合酶提取過程中各個酶均在最接近單一酶最優(yōu)pH的條件下進行提取，其它試驗條件同2.1，試驗結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出復(fù)合酶提取效果要優(yōu)于單一酶提取過程，特別是3種酶組成的復(fù)合酶，提取效果已經(jīng)優(yōu)于熱水提取法。

圖1 熱水浸提法與酶輔助提取的效果對比

圖2 熱水浸提法復(fù)合酶輔助提取效果對比

表1 不同復(fù)合酶的p H選擇

圖3 不同添加量的酶輔助提取效果對比

2.3 復(fù)合酶單因素考察實驗在確定出最佳酶解用酶后，進行了復(fù)合酶加入量與復(fù)合酶配比的單因素考察試驗，其它試驗條件不變。復(fù)合酶加入量考察試驗結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出在復(fù)合酶加入量為0.8%時提取效果達到最大值，之后開始出現(xiàn)下降，所以復(fù)合酶加入量確定為0.8%。再考察復(fù)合酶的最佳酶配比。三種酶分別按照1∶1∶1，1∶1∶2，1∶2∶1，2∶1∶1，2∶2∶1，2∶1∶2，1∶2∶2（木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶）七種不同比例復(fù)合，進行復(fù)合酶提取，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出配比為1∶2∶2的復(fù)合酶酶解提取效果最好，多糖得率達到了5.75 g/100 g。

圖4 不同配比復(fù)合酶輔助提取效果對比

2.4 復(fù)合酶最佳酶解條件正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在復(fù)合酶加入量0.8%的條件下，以試驗溫度，料液比，料液pH，反應(yīng)時間為考察因素，每個因素設(shè)定3個水平，進行4因素3水平的正交試驗（詳見表2）[9～10]。通過方差分析法分析[11～12]表3結(jié)果可知，對提取效果影響程度的重要性依次為反應(yīng)時間大于料液pH大于料液比大于反應(yīng)溫度，最佳酶解條件為反應(yīng)溫度45℃，料液比1∶30，料液pH4.5，反應(yīng)時間3 h。在此條件下進行復(fù)合酶的重復(fù)驗證性試驗，結(jié)果見圖5，試驗結(jié)果表明復(fù)合酶酶解提取所獲得的靈芝水提物中靈芝多糖的含量較熱水提取法提升20%以上。

表2 正交實驗表

表3 正交實驗數(shù)據(jù)分析表

圖5 重復(fù)性驗證試驗

3 結(jié) 論

通過單因素試驗與正交試驗可知，復(fù)合酶法提取靈芝多糖較熱水法有操作溫度低，提取效果好的優(yōu)點，復(fù)合酶最佳酶配比為木瓜蛋白酶∶纖維素酶∶果膠酶=1∶2∶2，最佳復(fù)合酶加入量為0.8%，最佳酶解條件為pH 4.5，溫度45℃，料液比1∶30，酶用量0.8%，酶解時間3 h，酶解次數(shù)2。對酶解效果影響程度從大到小依次為反應(yīng)時間大于料液比大于溫度等于料液pH。

復(fù)合酶酶解低溫提取靈芝多糖，較熱水提取法有著操作溫度低，能源消耗少，提取效果好的優(yōu)點，但因為酶制劑價格較高，且添加的是復(fù)合酶，所以在成本方面會有一定的提高，而且因為要對提取液中的酶進行滅活，增加了后續(xù)純化步驟中除蛋白的工作量。

研究主要考察完全酶法輔助低溫提取的可行性，在后續(xù)研究中將進一步研究酶制劑的回收，以期能減小酶制劑的消耗，有效降低生產(chǎn)成本。