王慶武 蘭玉菲 謝新國 安秀榮

（1泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東泰安271000；2東平縣州城鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，山東東平271506）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，靈芝屬，具有廣泛的藥理活性[1，2]。傳統(tǒng)的靈芝栽培所用菌種為固體菌種，其生產(chǎn)勞動強(qiáng)度大、生長周期長、污染率高，降低了靈芝的生產(chǎn)效率[3]，制約了靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。與固體菌種相比[4]，液體菌種具有生長速度快、菌齡一致、活力強(qiáng)、發(fā)菌快、成本低、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)，解決了固體菌種發(fā)菌慢、出芝不整齊和生產(chǎn)周期長的問題[3]，有利于提高靈芝產(chǎn)量和品質(zhì)。

研究以菌絲生物量作為目的指標(biāo)[5]，對碳源、氮源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)因子進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲得適宜靈芝液體菌種培養(yǎng)配方，為培育優(yōu)質(zhì)液體菌種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 自主選育泰山赤靈芝菌株4914（原生質(zhì)體單核雜交育種）。

1.1.2 母種培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g（去皮煮汁），麩皮40 g（煮汁），葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，瓊脂20 g，加水1000 mL。

1.1.3 一級搖瓶培養(yǎng)基 碳源優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨0.2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，花生油0.05%。

氮源優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，花生油0.05%。

1.1.4 營養(yǎng)因子 碳源：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、淀粉、玉米粉。

氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、（NH4）2SO4、NH4NO3、麩皮。

無機(jī)鹽：KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaSO4·2H2O。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液體培養(yǎng)基制備 在250 mL三角燒瓶中加入150 mL液體培養(yǎng)基，0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫?zé)o菌條件下接種。

1.2.2 接種培養(yǎng)方法 接入菌齡一致的5個4 mm2大小母種塊，27℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 碳源優(yōu)化試驗(yàn) 在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入7種碳源，含量2%，組合成供試培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)法參照1.2.2。

1.2.4 氮源優(yōu)化試驗(yàn) 在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入6種氮源，含量0.2%，組合成供試培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)法參照1.2.2。

1.2.5 碳氮源配比優(yōu)化試驗(yàn) 選定適宜碳氮源后，采用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，接種培養(yǎng)法參照1.2.2。

1.2.6 無機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn) 以最佳碳氮源組合為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入4種無機(jī)鹽，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，接種培養(yǎng)法方法同1.2.2。

1.2.7 菌絲生物量測定 各處理培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)液移入離心管離心機(jī)10 000 r/min離心5 min，50℃條件下菌絲烘至恒重，測定各處理菌絲生物量干重。

1.2.8 統(tǒng)計分析 采用Duncan新復(fù)極差對各處理進(jìn)行統(tǒng)計分析，分析各處理對菌絲生物量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對靈芝菌絲生物量的影響不同碳源培養(yǎng)基靈芝菌絲生物量均不同（表1），其中在以淀粉和玉米粉為碳源的培養(yǎng)基，菌絲生物量最高，且二者之間差異不顯著；供試的七種碳源利用率依次為淀粉、玉米粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖；在無碳源培養(yǎng)基，菌絲生物量最低，表明菌絲生長需要適宜的碳源。

表1 不同碳源對靈芝菌絲生物量的影響

2.2 不同氮源對靈芝菌絲生物量的影響不同氮源培養(yǎng)基靈芝菌絲生物量均不同（表2），其中以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基菌絲生物量最高，以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基菌絲生物量次之，二者之間差異不顯著；供試的六種氮源利用率依次為酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、麩皮、（NH4）2SO4、NH4NO3；在無氮源培養(yǎng)基，菌絲生物量最低，表明菌絲生長需要適宜的氮源。

表2 不同氮源對靈芝菌絲生物量的影響

2.3 碳氮源配比對靈芝菌絲生物量的影響選用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，確定碳氮源最佳配比。

表3 正交試驗(yàn)因素水平

正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果表明（表4），4個單因子對靈芝菌絲生物量的影響順序?yàn)椋篊＞A＞B＞D，說明酵母膏對菌絲生物量影響最大，其次是淀粉、玉米粉，牛肉膏對菌絲生物量影響最??；各因素對菌絲生物量的最佳碳氮源配比為A3B3C3D2。

表4 L 9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4無機(jī)鹽對靈芝菌絲生物量的影響選用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定無機(jī)鹽最佳配比。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表

正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果表明（表6），3個單因子對菌絲生物量的影響順序?yàn)椋篈＞C＞B，說明KH2PO4

表6 L 9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

對菌絲生物量影響最大，其次是CaSO4，MgSO4對菌絲生物量影響最小；各因素對菌絲生物量的最佳無機(jī)鹽配比為A3B3C1。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)表明，泰山赤靈芝菌絲對碳源的利用比較廣泛，既可利用各種糖類也可利用植物性原料，而植物性原料利用率好于糖類，且其價格較便宜，在增加菌絲生物量的同時可適當(dāng)降低成本，適宜的碳源為淀粉和玉米粉。

不同氮源對靈芝菌絲生長有一定的促進(jìn)作用[6]，有機(jī)氮比無機(jī)氮更有利于靈芝菌絲的生長，適宜的氮源為酵母膏和牛肉膏。

靈芝菌絲生長需要適宜的碳氮源配比[7]。通過L9（34）正交試驗(yàn)，對菌絲生物量進(jìn)行極差分析，表明適宜的碳氮比有利于靈芝菌絲的生長，即：淀粉3%，玉米粉4%，酵母膏0.3%，牛肉膏0.2%。

食用菌對無機(jī)鹽需要量很少，但它們對菌絲生長和代謝物的形成影響較大，是微生物活動中不可缺少的物質(zhì)[8]。試驗(yàn)表明，無機(jī)鹽濃度不宜過高，CaSO4對菌絲生長有一定的抑制作用，這與薛志明[3]的試驗(yàn)結(jié)果相一致，即無機(jī)鹽一般在低濃度時對菌絲生長有促進(jìn)作用，在高濃度時常表現(xiàn)出明顯的抑制作用，適宜的配比及用量：KH2PO40.25%，MgSO40.15%。