高效液相色譜法同時(shí)測定改善睡眠顆粒中天麻素、紅景天苷、梔子苷和斯皮諾素含量的應(yīng)用

張美玲+陳彥杰+趙亭+褚銀鈴+張潔+房艷+賈德賢

[摘要]目的 建立高效液相色譜同時(shí)測定“改善睡眠顆?！敝刑炻樗?、紅景天苷、梔子苷和斯皮諾素含量的方法。方法 檢測對象為以上提到的“改善睡眠顆?！敝械乃膫€(gè)主要成分。采用的色譜柱為Thermo Fisher Syncronis C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。檢測波長分別設(shè)定為220、238、275、335 nm。結(jié)果 天麻素、紅景天苷、梔子苷和斯皮諾素分別在0.8032～4.0160、0.5392～2.6960、2.6916～13.4580、0.2112～1.0560 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的均RSD<2.00%；加樣回收率分別為98.17%、99.37%、98.84%、99.27%；RSD分別為0.67%、0.48%、0.49%、0.93%。結(jié)論 高效液相色譜法可同時(shí)測定“改善睡眠顆?！敝刑炻樗?、紅景天苷、梔子苷和斯皮諾素的含量，且該方法簡便、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]改善睡眠顆粒；高效液相色譜；天麻素；紅景天苷；梔子苷；斯皮諾素

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）12（b）-0011-04

The application of simultaneous determination of Gastordine，Salidroside，Geniposide and Spinosin in “Gaishanshuimian Granules” by HPLC

ZHANG Mei-ling CHEN Yan-jie ZHAO Ting CHU Yin-ling ZHANG Jie FANG Yan JIA De-xian

Ovation Health Science and Technology Co.Ltd.，ENN Group，Langfang 065001，China

[Abstract]Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of four constituents （Gastordine，Salidroside，Geniposide，Spinosin） in “Gaishanshuimian Granules”.Methods Aforementioned four major constituents in “Gaishanshuimian Granules” as the detecting subject.Column was Thermo Fisher Syncronis C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）.Mobile phase was acetonitrile-water，gradient elute，flow rate was 1.0 ml/min.Column temperature was maintained at 30℃，sample size was 10 μl.Detection wavelengths were set at 220，238，275 and 335 nm.Results Linear range of Gastordine，Salidroside，Geniposide，and Spinosin respectively were 0.8032-4.0160，0.5392-2.6960，2.6916-13.4580，0.2112-1.0560 μg.The RSD of precision，stability and repeatability test were all less than 2.00%.The average recoveries respectively were 98.17%，99.37%，98.84% and 99.27% with RSD of 0.67%，0.48%，0.49% and 0.93%，respectively.Conclusion This developed HPLC method is reliable and convenient for simultaneous determination of Gastordine，Salidroside，Geniposide，and Spinosin，which could be applied to determine contents of four constituents and quality control of "Gaishanshuimian Granules".

[Key words]Gaishanshuimian Granules；HPLC；Gastordine；Salidroside；Geniposide；Spinosin

睡眠對人是必不可少的休息方式，通過睡眠使疲勞的神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)正常的生理功能，精神和體力得到恢復(fù)。然而，隨著社會(huì)的快速發(fā)展及生存環(huán)境的變化，具有睡眠方面障礙的人數(shù)量越來越多。睡眠障礙嚴(yán)重影響著人們的身心健康、生活質(zhì)量和工作效率。“改善睡眠顆?！庇商炻?、酸棗仁、紅景天及梔子等中藥組成，是新繹健康科技有限公司依據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)方加減，開發(fā)為具有改善睡眠作用的保健食品。方中天麻為君藥，酸棗仁為臣藥，天麻具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、益智等作用[1]，天麻素是天麻的主要成分，具有多種藥理作用，包括神經(jīng)衰弱綜合癥、阿爾茨海默病綜合癥、帕金森病等[2-4]。酸棗仁具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抗血小板聚集等作用[5-6]。斯皮諾素為黃酮碳苷類成分，是酸棗仁主要成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明能顯著增強(qiáng)戊巴比妥誘導(dǎo)的睡眠，表現(xiàn)在睡眠時(shí)間增加和睡眠潛伏期減少，其作用機(jī)制可能與拮抗5-HT（1A）受體有關(guān)[7-8]。藏藥紅景天是我國珍貴的藥材，享有“高原人參”的美譽(yù)，紅景天除用于治療高原反應(yīng)，近年研究表明具有抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、治療心血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[9]，主要成分紅景天苷是研究的熱點(diǎn)，已報(bào)道的藥理作用有抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、增強(qiáng)記憶、改善睡眠等[10-11]。梔子為藥食兩用的物品，不僅在中醫(yī)臨床中經(jīng)常使用，在食品與保健食品中也應(yīng)用廣泛，現(xiàn)代藥理研究表明，梔子具有保肝利膽、降壓、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用[12]，其主要活性成分是梔子苷和梔子黃色素，梔子苷也呈現(xiàn)多種藥理作用[13]。基于以上分析，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC方法同時(shí)測定“改善睡眠顆?！敝刑炻樗?、紅景天苷、梔子苷及斯皮諾素四個(gè)主要成分的含量，可以較好的反應(yīng)該制劑的作用物質(zhì)基礎(chǔ)，為其質(zhì)量控制研究提供參考。

1材料

1.1儀器和設(shè)備

Thermo Ultimate 3000雙三元高效液相色譜儀[（DGLC），美國賽默飛世爾公司]；十萬分之一分析天平（瑞士 Mettler-Toledo公司）；KQ250DB型超聲波清洗儀（昆山市超聲波儀器有限責(zé)任公司）。

1.2藥品與試劑

“改善睡眠顆粒”及其提取物中間體均為新奧集團(tuán)新繹健康科技有限公司提供。天麻素、紅景天苷、梔子苷、斯皮諾素對照品均購自于北京欣榮科技有限公司（批號分別為150708、150619、150612、150807）。乙腈為色譜純，水為高純水；除另有規(guī)定外，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Thermo Fisher Syncronis C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相，洗脫梯度為0～3 min，6%A；3～13 min，6%～18%A；13～22 min，18%～40%A；22～23 min，40%～6%A；23～30 min，6%A。流速1.0 ml/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μl。按上述色譜條件，各成分分離度良好，測定結(jié)果見圖1和圖2。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液制備 精密稱取對照品適量，置入10 ml量瓶中，用甲醇溶解定容，配制濃度分別為天麻素200.8 μg/ml、紅景天苷134.8 μg/ml、梔子苷672.9 μg/ml、斯皮諾素52.8 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取“改善睡眠顆粒”提取物中間體及小試顆粒各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25 ml，稱定重量，超聲處理（功率100 W，頻率45 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對照品溶液4、8、12、16、20 μl注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x），峰面積值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得各成分的回歸方程（表1）。

2.4精密度試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，連續(xù)測定6次，記錄各成分峰面積。結(jié)果，天麻素、紅景天苷、梔子苷和斯皮諾素峰面積的RSD分別為0.50%、0.23%、0.20%和0.23%，表明儀器的精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下制備的樣品溶液各20 μl，分別在配置后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積。結(jié)果表明天麻素、紅景天苷、梔子苷和斯皮諾素峰面積的RSD分別為1.94%、0.59%、0.75%和1.64%，表明對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批小試顆粒樣品6份，按“2.2”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄各成分峰面積，結(jié)果表明天麻素、紅景天苷、梔子苷和斯皮諾素峰面積的RSD分別為0.70%、0.45%、0.67%和1.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同法測定的已知含量小試顆粒樣品共6份，分別精密加入混合對照品適量，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，記錄各成分峰面積，經(jīng)計(jì)算結(jié)果如表2，回收率在98.0%～99.5%，表明本法準(zhǔn)確度較好。

2.8樣品含量的測定

取一批小試顆粒和四種提取工藝下的提取物中間體。按“2.2.2”項(xiàng)下進(jìn)行溶液制備，平行制備3份。按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

本實(shí)驗(yàn)確定的方法同時(shí)測定樣品（四種工藝下制備的復(fù)方提取物及小試顆粒樣本）中天麻素、紅景天苷、梔子苷及斯皮諾素的含量進(jìn)行了測定，四種成分都能檢出，并且能夠完全分離，說明此法可以指導(dǎo)提取工藝的優(yōu)化及樣品的質(zhì)量控制。

3討論

3.1提取溶劑的選擇

供試品制備過程中，根據(jù)指標(biāo)性成分的性質(zhì)，選擇甲醇、60%甲醇、30%甲醇和水為提取溶劑，超聲提取40 min，發(fā)現(xiàn)甲醇濃度越高不溶物越多。水為溶劑時(shí)提取溶液較澄清，各成分能達(dá)到有效分離，且各成分的提取率最高，故最終選擇水作為提取溶劑。

3.2 檢測波長的選擇

根據(jù)《中國藥典》2015年版天麻、梔子、紅景天和酸棗仁項(xiàng)下的規(guī)定，天麻素、紅景天苷、梔子苷和斯皮諾素的最大吸收波長分別為220、238、275、335 nm[14]，因此，分別在以上波長下積分計(jì)算峰面積，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 流動(dòng)相的選擇

天麻素、梔子苷、紅景天苷和斯皮諾素在《中國藥典》2015年版中各成分測定的色譜條件中流動(dòng)相除紅景天苷使用甲醇-水外，其余都是乙腈-水；水相只有測定天麻素時(shí)是0.05%磷酸水溶液，同時(shí)也參考了文獻(xiàn)報(bào)道的液相條件[15-18]，確定本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)測定這四種成分含量的流動(dòng)相為乙腈-水。經(jīng)過摸索確定適合的洗脫程序，各成分峰型良好，且分離度均>1.5。本文確定的同時(shí)測定“改善睡眠顆?！敝刑炻樗亍⒓t景天苷、梔子苷及斯皮諾素含量的HPLC方法，樣品制備方法簡單，分離效果良好，專屬性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性較好，為提取工藝的確定提供依據(jù)，為“改善睡眠顆?！辟|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1]劉劍，閆建坤.天麻素氯化鈉注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（30）：8-11.[2]陳貴生.天麻素藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2015，（S1）：281-283.

[3]龔其海，石京山，楊丹莉，等.天麻素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥理作用及其機(jī)制[J].中藥新藥與臨床雜志，2011，30（3）：176-179.

[4]李紅月，孫志偉，王淑琴.天麻素在神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用研究概況[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（11）：1047-1050.

[5]馬進(jìn)杰，劉萍，馬百平.酸棗仁化學(xué)成分及其鎮(zhèn)靜催眠作用研究進(jìn)展[J].國際藥學(xué)研究雜志，2011，38（3）：206-211.

[6]陳雯，黃世敬.酸棗仁化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（7）：1726-1728.

[7]Wang LE，Bai YJ，Shi XR，et al.Spinosin，a C-glycoside flavonoid from semen Zizhiphi Spinozae，potentiated pentobarbital-induced sleep via the serotonergic system[J].Pharmacol Biochem Behav，2008，90（3）：399-403.

[8]Wang LE，Cui XY，Cui SY，et al.Potentiating effect of spinosin，a C-glycoside flavonoid of Semen Ziziphi spinosae，on pentobarbital-induced sleep may be related to postsynaptic 5-HT（1A）receptors[J].Phytomedicine，2010，17（6）：404-409.

[9]孫健，李克明.紅景天藥理研究和臨床作用[J].中醫(yī)臨床研究，2016，8（6）：144-146.

[10]Wu WY，Hou JJ，Long HL，et al.TCM-based new drug discovery and development in China[J].Chin J Nat Med，2014， 12（4）：241-250.

[11]劉志會(huì).紅景天苷藥理作用及機(jī)制[J].天津藥學(xué)，2016，28（2）：67-69.

[12]牧丹，蘇日那，格根塔娜，等.梔子的化學(xué)成分與藥理作用研究[J].中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2015，24（1）：34-36.

[13]王恩力，董方，姚景春.梔子苷藥理學(xué)和毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國藥房，2015，26（19）：2730-2733.

[14]國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：58，154，248，366.

[15]章運(yùn)典，周里欣，陳洪英.RP-HPLC法同時(shí)測定天智顆粒中天麻素、梔子苷、蘆丁和黃芩苷[J].中成藥，2014，6（8）：1670-1673.

[16]臧文怡，毛春芹，蘇曉楠，等.HPLC同時(shí)測定益經(jīng)顆粒中芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷和斯皮諾素的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（5）：60-63.

[17]祝洪艷，張力娜，唐姍，等.HPLC法測定3個(gè)產(chǎn)地酸棗仁中斯皮諾素和酸棗仁皂苷A、B的含量[J].藥物分析雜志，2015，35（12）：2099-2104.

[18]師永清，康淑荷，王愛軍.HPLC 法同時(shí)測定導(dǎo)赤丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和鹽酸小檗堿[J].中成藥，2013，35（7）：1462-1465.