陳燁+鄒聰華+鄭曉春

摘要]目的 探討鞘內(nèi)注射艾司洛爾對(duì)甲醛炎性大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表達(dá)的影響。方法 鞘內(nèi)置管后，36只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)學(xué)表法分為3組（n=12）：生理鹽水組（N組），300 μg/kg（S1組），600 μg/kg（S2組）。鞘內(nèi)置管5 d后，注射以上各組藥物，然后在大鼠后肢皮下注射甲醛50 μl ，以Von-Frey細(xì)絲法和Hargreaves法測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值（MWT）和熱刺激縮足反射潛伏期（TWL），觀察大鼠的疼痛行為學(xué)變化。觀察1.5 h后，采用RT-PCR方法觀察脊髓背角L4～5 COX-2 mRNA表達(dá)。 結(jié)果 與N組比較，S1、S2組的Ⅱ相階段的疼痛行為均有所減少，且S1、S2組L4～5 節(jié)段脊髓表達(dá)的COX-2 mRNA的量均比N組少（P<0.01）。結(jié)論 鞘內(nèi)注射艾司洛爾可減少甲醛大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]疼痛；脊髓；艾司洛爾；環(huán)氧化酶-2

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）12（b）-0135-03

Effect of Esmolol on the expression of COX-2 mRNA in spinal cord of inflammatory rats

CHEN Ye ZOU Cong-hua ZHENG Xiao-chun

Department of Anesthesiology，F(xiàn)ujian Provincial Hospital，F(xiàn)uzhou 350000，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of intrathecal injection of Esmolol on the expression of COX-2 mRNA in the spinal dorsal horn of formaldehyde-induced inflammatory rats.Methods After the intrathecal catheterization，36 SD rats were randomly divided into 3 groups （n=12）：saline group （group N），300 μg/kg group （group S1），and 600 μg/kg group （group S2）.5 days after the intrathecal catheterization，the drug of each group was given to the rats respectively and then 50 μl formaldehyde was injected subcutaneously in the hind limbs of rats.Von-Frey method and Hargreaves method were adopted to measure the mechanical withdrawal threshold （MWT） and thermal withdrawal latency （TWL） so as to observe the pain behavioral changes in rats.After 1.5 hours observation，RT-PCR was given to observe COX-2 mRNA expression in L4～5 spinal dorsal horn.Results Compared with group N，phase II pain behaviors in group S1 and group S2 were reduced and the expression of COX-2 mRNA in L4～5 spinal dorsal horn in group S1 and group S2 was less than that in group N （P<0.01）.Conclusion Intrathecal injection of Esmolol reduces COX-2 mRNA expression in the spinal dorsal horn of formalin-induced rats.

[Key words]Pain；Spinal cord；Esmolol；Cyclooxygenase 2

腎上腺素受體分布于大部分交感神經(jīng)節(jié)后纖維所支配的效應(yīng)器細(xì)胞膜上，其受體分為 3 種類型， 即β1受體、β2受體和β3受體。β1受體主要分布于心肌，可激動(dòng)引起心率和心肌收縮力增加，其代表為艾司洛爾，近幾年被廣泛應(yīng)用于臨床。有研究發(fā)現(xiàn)該阻滯藥可減少麻醉維持藥物的用量[1-4]，而靜脈注射艾司洛爾可減少丙泊芬的注射痛[5]，但β1受體阻滯藥艾司洛爾是否具有調(diào)節(jié)疼痛的作用仍未闡明。環(huán)氧化酶（COX）是前列腺素合成的一個(gè)重要限速酶，在體內(nèi)存在2種形式：COX-1 和COX-2，而COX-2/PG 通路參與傷害性疼痛在脊髓水平的傳遞。本研究擬通過(guò)鞘內(nèi)注射艾司洛爾，觀察大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表達(dá)的變化，來(lái)探索艾司洛爾是否具有疼痛調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

Microspianl導(dǎo)管（美國(guó)ALZA公司），鹽酸艾司洛爾注射液（山東齊魯制藥廠，批號(hào)20130232），5%甲醛（生理鹽水3.2 ml+37%甲醛 0.5 ml），real time PCR儀（TAKARA公司，日本）MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR劑盒（Invitrogen Life公司，美國(guó)）。

1.2鞘內(nèi)置管

SD雄性大鼠，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重260～290 g。用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射，參照方法[5]，鞘內(nèi)置管。置管隔天行注射2%利多卡因?qū)嶒?yàn)，未出現(xiàn)雙下肢無(wú)力的大鼠剔除。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

將置管成功大鼠隨機(jī)分為3組（n=12）：生理鹽水組（N組），艾司洛爾300 μg/kg組（S1組），艾司洛爾600 μg/kg組（S2組）。置管后5 d，大鼠注射各組藥物后在同側(cè)足掌皮下注射5%甲醛50 μl。

1.4炎性疼痛大鼠的制備

置管后5 d，所有大鼠注射藥物后均在一側(cè)足掌皮下注射5%甲醛50 μl。

1.5疼痛行為的觀察

以Von-Frey細(xì)絲法[5]和Hargreaves法[6]測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值（MWT）和熱刺激縮足反射潛伏期（TWL），觀察大鼠術(shù)后2 h的疼痛行為學(xué)變化。每只大鼠測(cè)定5次，每次間隔3 min，取平均值。注入甲醛后3組大鼠繼續(xù)存活1.5 h。

1.6 RT-PCR檢測(cè)COX-2 mRNA表達(dá)

大鼠均在注射甲醛后1.5 h斷頭處死，剪開脊柱肌肉及椎板，暴露脊髓和L5神經(jīng)節(jié)，截取L4～5段脊髓。以Trizol（Gibco公司）一步法提取脊髓組織總RNA。取1 μg總RNA用RT-PCR kit（Takara）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μl為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，COX-2引物上游序列：5′-ACACTCTATCACTGGCATCC-3′，下游序列：5′-GAAGGGACACCCTTTCACAT-3′， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為584 bp；內(nèi)參照β-actin 上游序列5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，下游序列5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為265 bp，由寶生物工程公司合成。循環(huán)條件為94℃ 60 s，56℃ 90 s，72℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP計(jì)算機(jī)圖像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定電泳條帶密度值，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算COX-2 mRNA的相對(duì)含量，以COX-2條帶密度與β-actin條帶密度比值反應(yīng)COX-2 mRNA表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組疼痛行為學(xué)的比較

NS 組、S1 組、S2 組注射甲醛后出現(xiàn)疼痛反應(yīng)，表現(xiàn)為注射足只能稍受力或不能受力，抬起甚至舔咬注射足。與N組相比，S1、S2組MWT均降低，TWL縮短（P<0.01）（表1）。

2.2 RT-PCR結(jié)果

S1、S2組電泳條帶明顯變暗，與β-actin條帶密度比值變小，大鼠L5脊髓的COX-2 mRNA的表達(dá)均下降（P<0.01）（表2）。

3討論

急慢炎性疼痛實(shí)驗(yàn)中，甲醛實(shí)驗(yàn)是具有代表性的模型[7-8]，被廣泛應(yīng)用于疼痛相關(guān)機(jī)制及止痛藥的評(píng)價(jià)。有研究表明，大鼠后足注射甲醛后即可出現(xiàn)2個(gè)疼痛機(jī)制不同的反應(yīng)時(shí)相：Ⅰ相（5～10 min）是甲醛直接刺激外周傷害感受器所致；Ⅱ相（15～50 min）是主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元興奮性增加而導(dǎo)致中樞敏化有關(guān)[9-10]。本研究中N組大鼠足底注射甲醛后， 大鼠出現(xiàn)明顯的兩相疼痛反應(yīng)， 表明大鼠出現(xiàn)了炎性疼痛及痛覺(jué)過(guò)敏， Ⅱ相N組的時(shí)間顯著高于S1、S2組， 提示艾司洛爾能抑制炎性反應(yīng)所導(dǎo)致的第二期的疼痛中樞敏感化， 這可能與艾司洛爾抑制交感神經(jīng)有關(guān)。

本研究檢測(cè)的COX-2正常情況下在脊髓表達(dá)水平很低或無(wú)，當(dāng)外周受疼痛刺激時(shí)，脊髓背角淺層神經(jīng)元中COX-2 mRNA將迅速增加，在2 h達(dá)到高峰。脊髓背角淺層（Ⅰ、Ⅱ板層）是接收軀體傷害性信息的初級(jí)處理中心和對(duì)傷害信息反應(yīng)的重要部位，而COX-2表達(dá)的上調(diào)在脊髓背角分布脊髓處理傷害性感受的區(qū)域相一致[11]。故可認(rèn)為COX-2在傷害性信息的傳遞中發(fā)揮著重要的作用。本研究中甲醛致炎后的大鼠脊髓背角均可見高表達(dá)的COX-2，說(shuō)明存在傷害性刺激的持續(xù)性傳入。這是由于局部分泌大量的炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6 等，這些致炎物質(zhì)在神經(jīng)根周圍形成“炎癥湯”，持續(xù)刺激神經(jīng)產(chǎn)生異位放電，不斷轟擊脊髓背角，從而使COX-2通路處于長(zhǎng)期激活狀態(tài)[12-13]。

本研究表明，艾司洛爾呈劑量依賴地減少甲醛炎性大鼠Ⅱ相的疼痛行為，并且抑制了脊髓背角COX-2 mRNA表達(dá)。Satoshi發(fā)現(xiàn)蘭地洛爾可減少甲醛炎性大鼠脊髓c-fos mRNA表達(dá)[14]，也表明了β1受體阻滯劑具有減少炎性疼痛的作用。有研究發(fā)現(xiàn)β1受體阻滯劑阻滯感覺(jué)神經(jīng)中的河豚毒素相關(guān)的Na+離子通道[15-16]，他發(fā)現(xiàn)β-受體阻滯劑能激活游離細(xì)胞膜上的G-蛋白，產(chǎn)生突觸后或突觸前抑制，減少神經(jīng)介質(zhì)的釋放，提示β-受體阻滯劑對(duì)疼痛有中樞抑制作用，雖然艾司洛爾脂溶性低、在血液中被快速代謝，但并不排除其具有中樞作用的可能性。本研究采用置管給藥，理論上存在局部吸入血引起全身效應(yīng)，但艾司洛爾是超短效藥，不可能持續(xù)存在幾個(gè)小時(shí)的鎮(zhèn)痛作用，所以推斷艾司洛爾在脊髓水平參與了疼痛的調(diào)節(jié)。雖然鞘內(nèi)單獨(dú)應(yīng)用艾司洛爾的鎮(zhèn)痛效應(yīng)不足以完全逆轉(zhuǎn)痛行為，但其獨(dú)特的抗損傷效應(yīng)和累積的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，可能使其成為新的鞘內(nèi)鎮(zhèn)痛的輔助用藥。由于國(guó)內(nèi)外對(duì)艾司洛爾調(diào)節(jié)疼痛研究少，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究并闡明。

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