許慈++蔡懿婷++董晴晴++王碧君++戴強++朱黎明

[摘要] 目的 探討沉默磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）p110β因子的表達對人胃癌細胞生長的影響。 方法 運用RNA干擾技術(shù)，合成靶向抑制PI3Kp110β的小干擾RNA（siRNA）序列并分別瞬時轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株AGS、SGC7901和MKN45（si-PI3Kp110β），作為實驗組，未轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照組（Con），轉(zhuǎn)染無義序列的siRNA為陰性對照組（si-NC）。采用RT-PCR和Western Blot方法驗證瞬時轉(zhuǎn)染后PI3Kp110β mRNA和蛋白在空白對照組（Con）、陰性對照組（si-NC）和實驗組（si-PI3Kp110β）細胞中的表達水平，并通過MTT法檢測細胞增殖及Annexin V-FITC/PI雙染法檢測AGS細胞凋亡率的情況。 結(jié)果 小分子干擾RNA（siRNA）瞬時轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株AGS、SGC7901和MKN45后，能有效下調(diào)PI3Kp110β在細胞內(nèi)的表達水平。與陰性對照組（si-NC）比較，靜默PI3Kp110β因子可減少AGS細胞的增殖（P < 0.05），并明顯增加AGS細胞的凋亡率（P < 0.01）。 結(jié)論 小分子干擾RNA可有效下調(diào)PI3Kp在人胃癌細胞中的表達，沉默PI3Kp110β因子可有效抑制胃癌腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡，提示針對PI3Kp110β 蛋白的干預(yù)治療有可能成為抑制胃癌細胞生長的一個新的治療方法。

[關(guān)鍵詞] 磷脂酰肌醇3-激酶p110β； RNA干擾；胃腫瘤；增殖；凋亡

[中圖分類號] R734 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（b）-0028-05

Study on the effects of target inhibiting phosphoinositide 3-kinases p110beta on the growth of human gastric cancer cells

XU Ci CAI Yiting DONG Qingqing WANG Bijun DAI Qiang ZHU Liming▲

Department of Gastroenterology， No.3 People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 201999， China

[Abstract] Objective To study the effect of PI3Kp110β silencing on growth of human gastric cancer cells in vitro. Methods The small interfering RNA sequence targeted by PI3Kp110β and negative sequence was transfected into gastric carcinoma cells including AGS， SGC7901 and MKN45 for 48 h respectively by RNA interfering （si-PI3Kp110β group）. Other two groups include untransfected cells （Con group） and nonsense siRNA sequence transfected cells （si-NC group）. The mRNA and protein expression of PI3Kp110β were determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR） and Western blotting. The cellular proliferation was measured by MTT assay， and cell apoptosis was determined by flow cytometry in AGS cells. Results The expression level of PI3Kp110β was downregulated significantly in si-PI3Kp110β group in three human gastric carcinoma cell lines AGS， SGC7901 and MKN45. The cell proliferation was decreased （P < 0.05） and cell apoptosis was significantly increased （P < 0.01） in si-PI3Kp110β group compared with si-NC group in AGS cells. Conclusion The expression of PI3Kp110β in gastric cancer cells is effectively decreased with RNA interference. Silencing PI3Kp110β expression can effectively inhibit the proliferation of gastric carcinoma cells and induce cell apoptosis. siRNA targeting PI3Kp110β may become one of the methods to treat gastric carcinoma.

[Key words] PI3Kp110β； RNA interference； Gastric neoplasm； Proliferation； Apoptosis

胃癌是常見的消化道腫瘤，在我國胃癌患者5年生存率低，尋找關(guān)鍵的腫瘤信號調(diào)節(jié)因子，可為其治療帶來突破。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路在腫瘤轉(zhuǎn)移以及耐藥中發(fā)揮重要作用[1]。PI3K家族分為3種亞型，深入研究的是ⅠA型PI3K，由p85調(diào)節(jié)亞單位和p110催化亞單位組成，可被細胞表面酪氨酸激酶受體所激活。p110有α、β和δ 3個亞型組成。其中，編碼p110β蛋白的PIK3CB基因在腫瘤增殖與遷移中的發(fā)揮的作用越為明顯[2-4]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，PI3Kp110β在人胃癌組織中表達的陽性率高于正常癌旁組織，在分化越低、浸潤程度越深以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，其表達程度越高，提示PI3Kp110β的表達可能與胃癌的分化程度以及臨床分期等關(guān)系密切[5]。本研究擬在此基礎(chǔ)上，采用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株，觀察干擾前后PI3Kp110β在各胃癌細胞株中的表達，深入探討PI3Kp110β對人胃癌細胞增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑以及儀器

人胃癌細胞株AGS、MKN45及SGC7901（購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所，保存），均為貼壁生長的細胞，傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Gibco）的RPMI1640培養(yǎng)液中（37℃、5%CO2）。

cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，大連寶生物公司）；2×TaqPCR MasterMix和Trizol試劑（北京天根生化公司）；BCA法蛋白定量試劑盒（Pierce公司）；PI3Kp110β抗體（Abcam公司，Ab32569）；β-actin抗體（Sigma公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔和抗小鼠的二抗（Goat Anti-Rabbit IgG，Goat Anti-Mouse IgG HRP Conjugated）（北京康為世紀(jì)公司）；增強型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）（Bio-Rad公司）；噻唑藍（MTT）粉、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（BD公司）。

PCR儀（AB Applied Biosystems）；Fusion FX7化學(xué)發(fā)光儀（Vilber Lourmat公司）；流式細胞儀（BD公司）；熒光顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染

將培養(yǎng)的3種人胃癌細胞株AGS、SGC7901和MKN45接種于6 mm培養(yǎng)皿中（細胞密度為3×105個/皿），分為實驗組（si-PI3Kp110β）和陰性對照組（si-NC或siFAM-NC），分別轉(zhuǎn)染PI3Kp110β siRNA和不含（或含）綠色熒光的無義序列。采用脂質(zhì)體Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）進行轉(zhuǎn)染，先采用OPTI-MEM（Gibco）培養(yǎng)，siRNA轉(zhuǎn)染6 h后，在培養(yǎng)皿中均加入等體積的含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，24 h后更換新的含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液并繼續(xù)孵育48 h。PI3Kp110β-siRNA序列，正義鏈：5′-GUUGGAAUGAACCACUGGAAUUU-3′，反義鏈：5′-AAAUUCCA？鄄 GUGGUUCAUUCCA-3′；陰性對照序列，正義鏈：5′-UUCUCCGAACGU？鄄GUCACGU-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′；上述序列由上海吉瑪制藥公司合成。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

采用Trizol法提取細胞總RNA，Nanodrop 2000儀器（Thermo公司）測量RNA濃度。PIK3CB引物序列和內(nèi)參照GAPDH引物序列由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PIK3CB引物上游：5′-TATTTGGACTTTGCGACAAGACT-3′；下游：5′-TCGAACGTACTGGTCTGGATAG-3′，產(chǎn)物大小190 bp。GAPDH引物上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游：5′- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，產(chǎn)物大小197 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠（含0.1%核酸染色試劑，泛博生物公司）電泳，100V電壓40 min。將凝膠在化學(xué)發(fā)光儀上進行成像、拍照和分析。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法

在細胞中加入含蛋白酶抑制劑（PIC，Sigma公司）的RIPA裂解液（上海申能博彩公司）100 μL/皿；冰上裂解抽提細胞蛋白，BCA法進行蛋白定量；每一樣本取20 μg蛋白質(zhì)，加入適量1×SDS上樣緩沖液（碧云天公司），煮沸5～10 min后置于冰上。配好8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣、垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，1 h后分別加入特異性PI3Kp110β抗體（1∶1000）和內(nèi)參照β-actin抗體（1∶5000），4℃冰箱搖床孵育過夜；分別加入對應(yīng)的二抗，室溫搖床上孵育1 h，TBS-T液體洗膜3次，每次10 min，在膜上加入ECL發(fā)光液進行顯影，用化學(xué)發(fā)光儀進行攝像和拍照。PI3Kp110β蛋白分子質(zhì)量為123 kD，β-actin為42 kD。

1.5 MTT法檢測細胞增殖

胃癌細胞株AGS轉(zhuǎn)染48 h后，以5×103/孔的密度將實驗組（si-PI3Kp110β）和陰性對照組（si-NC）細胞分別接種于96孔板，以未轉(zhuǎn)染任何siRNA的胃癌細胞株AGS作為空白對照組（CON），每組設(shè)4個復(fù)孔，分別于接種后24、48、72 h加入5 mg/mL MTT試劑20 μL/孔，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，棄MTT，加入DMSO 100 μL/孔，0.5 h后于波長570 nm處測定吸光度（A）值。細胞增殖率=實驗孔A值/空白孔A值×100%。上述MTT實驗均重復(fù)3次。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

在AGS細胞中，將轉(zhuǎn)染PI3Kp110β-siRNA序列和NC-siRNA序列72 h的細胞以及空白對照組細胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次；用無酚紅的0.25%胰酶-EDTA消化，加入緩沖液制成細胞懸液，離心，予PBS洗滌2次，每組加入緩沖液400 μL；先后加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μL，室溫避光放置15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。凋亡實驗重復(fù)3次，取均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小干擾RNA轉(zhuǎn)染效率檢測

將帶綠色熒光標(biāo)記的陰性對照序列（siFAM-NC）轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株AGS，48 h后熒光顯微鏡下觀察，見細胞質(zhì)和胞核均有點狀或小片狀綠色熒光顯示（圖1A，封三），與普通光鏡下相同位置細胞圖片相比（圖1B，封三），約80%以上的細胞均有不同程度的綠色熒光顯示，表明siRNA序列可有效轉(zhuǎn)染AGS細胞。

2.2 人胃癌細胞株中si-PI3Kp110β干擾效率檢測

為了檢測PI3Kp110βsiRNA的干擾效率，運用RT-PCR檢測PIK3CB mRNA表達，Western Blot法分析PI3Kp110β蛋白表達水平。結(jié)果顯示，在AGS細胞中，與陰性對照組（si-NC）相比，實驗組（si-PI3Kp110β）中PIK3CB基因表達明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），同時，實驗組（si-PI3Kp110β）蛋白表達水平也顯著下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）；而空白對照組（Con）與陰性對照組（si-NC）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（圖2）。用RT-PCR方法檢測SGC7901和MKN45細胞中的各組PIK3CB mRNA水平與AGS結(jié)果相似（圖3）[1]。表明si-PI3Kp110β轉(zhuǎn)染上述3種人胃癌細胞株后可有效下調(diào)PIK3CB基因及其蛋白產(chǎn)物PI3Kp110β在細胞內(nèi)的表達。

A：PIK3CB基因在空白對照組（Con）、陰性對照組（si-Nc）及實驗組（si-PI3Kp11β）中的mRNA表達條帶及相對表達量；與si-NC比較，P=0.001；B：PI3Kp110β蛋白在空白對照組（Con）、陰性對照組及實驗組（si-PI3Kp11β）中的蛋白表達條帶及相對表達量；與si-NC比較，P=0.002；Con：空白對照組；si-NC：陰性對照組；si-PI3Kp110β：實驗組

圖2 PI3Kp110β在人胃癌細胞AGS中各處理組的基因

和蛋白表達水平

在SGC7901細胞中，與si-NC比較，P=0.004；在MKN45細胞中與si-NC比較，P=0.001；Con：空白對照組；si-NC：陰性對照組；si-PI3Kp110β：實驗組

圖3 PI3Kp110β在SGC7901和MKN45細胞中

PI3Kp110β基因表達條帶及相對表達量

2.3 沉默PI3Kp110β的表達對胃癌細胞增殖的影響

為了檢測PI3Kp110β蛋白對人胃癌細胞株增殖的作用，MTT實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)24、48、72 h后，陰性對照組（si-NC）AGS細胞增殖率分別為（100.45%±7.58）%、（106.16%±8.39）%、（106.71%±3.60）%；實驗組（si-PI3Kp110β）細胞增殖率分別為（96.86%±7.64）%、（96.31%±6.77）%、（92.07%±5.68）%。實驗組（si-PI3Kp110β）的細胞增殖率在各時間點，較陰性對照組（si-NC）相比均有下降，其中作用72 h時間點的兩組細胞增殖能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（圖4）。表明瞬轉(zhuǎn)si-PI3Kp110β下調(diào)PI3Kp110β表達可減少AGS細胞的增殖。

與si-NC比較，*P < 0.05；si-NC：陰性對照組；PI3Kp110β：實驗組

圖4 siRNA轉(zhuǎn)染AGS細胞24、48、72 h的細胞增殖率

2.4 沉默PI3Kp110β的表達對胃癌細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染的流式細胞學(xué)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h后，空白對照組（Con）、陰性對照組（si-NC）以及實驗組（si-PI3Kp110β）細胞早期凋亡率分別為（2.07%±0.75）%、（2.48%±0.73）%、（23.88%±4.48）%。與陰性對照組（si-NC）相比，實驗組（si-PI3Kp110β）細胞凋亡率明顯增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）（圖5）；而陰性對照組（si-NC）與空白對照組（Con）相比，細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。由此可表明轉(zhuǎn)染si-PI3Kp110β 72 h后可明顯增加AGS細胞的凋亡率。

與si-NC比較，*P < 0.01；Con：空白對照組；si-NC：陰性對照組；PI3Kp110β：實驗組

圖5 siRNA轉(zhuǎn)染AGS細胞72 h各組細胞早期凋亡率比較

3 討論

PI3K/Akt通路是體內(nèi)重要生長因子通路之一，主要作用是激活細胞內(nèi)的抗凋亡機制，促進細胞生長和增殖[6]。PI3K功能異常與許多疾病如慢性炎癥和腫瘤相關(guān)[7]。在此通路中，Ⅰ型PI3K研究最為廣泛，具備磷脂酰肌醇激酶以及絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性[8]。該通路的異常，導(dǎo)致細胞增殖、代謝能力增強，抑制凋亡信號，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K中催化亞單位P110β在G蛋白偶聯(lián)受體信號通路[10]、細胞周期調(diào)控[11]、DNA復(fù)制[12]和細胞代謝[13]中起作用，另有研究表明，P110β在人乳腺癌、類卵巢癌以及前列腺癌中表達增高[14-16]，可能是結(jié)腸腺瘤發(fā)展為結(jié)腸癌的重要原因之一[17]。筆者前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，PI3Kp110β在人胃癌組織中的水平顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，胃癌患者中PI3Kp110β表達水平強陽性患者的5年生存率顯著低于PI3Kp110β表達水平弱陽性或陰性患者，預(yù)示胃癌組織中PI3Kp110β水平的表達的高低能提示胃癌患者的預(yù)后[5]。

在此基礎(chǔ)上，本文先合成靶向抑制PI3Kp110β的小干擾RNA序列，轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株，后運用PCR和Western Blot法，檢測轉(zhuǎn)染靶向抑制PI3Kp110β的小干擾RNA后腫瘤細胞株中PIK3CB基因表達以及PI3Kp110β蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)靶向抑制PI3Kp110β的小干擾RNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞可有效降低細胞中PI3Kp110β的表達。

有研究表明，運用RNA干擾技術(shù)，在乳腺癌[18]、子宮內(nèi)膜癌[19]和惡性膠質(zhì)瘤[20]中可抑制PI3Kp110β的表達，有效抑制該腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制該腫瘤細胞的生長。本研究通過MTT實驗證實腫瘤細胞的增殖能力在序列轉(zhuǎn)染后受抑制，且細胞凋亡率有顯著增加。以上結(jié)果表明，下調(diào)人胃癌細胞AGS中PI3Kp110β的水平可能起到抑制腫瘤細胞的增殖以及促進腫瘤細胞的凋亡的作用。

綜上所述，本實驗研究發(fā)現(xiàn)PI3Kp110β siRNA瞬時轉(zhuǎn)染人胃癌細胞可有效下調(diào)腫瘤細胞中PI3Kp110β的表達，并抑制人胃癌細胞的增殖，促進其凋亡。提示抑制PI3Kp110β 可能成為抗胃癌細胞生長的一個新靶點。

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（收稿日期：2016-09-02 本文編輯：程 銘）