史磊　范純玲　石鑫磊

[摘要]目的提高北合歡中藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法增加薄層色譜鑒別方法；槲皮素、山柰素的HPLC含量測(cè)定方法，色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus c18（5um，4.6mm×250mm），流動(dòng)相甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50），流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。結(jié)果薄層色譜圖斑點(diǎn)顯色清晰，色譜分離良好；槲皮素在進(jìn)樣量0.001-1ug、山柰素在進(jìn)樣量0.005-10ug范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，y=3847.7x+0.4811（r=1.0000）、y=4329.5x+84.852（r=0.9998）；平均回收率96.4%（RSD1.7%）。結(jié)論本研究為提高北合歡藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

[關(guān)鍵詞]北合歡；薄層色譜法；高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)]R931

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2017）03-49-04

北合歡別名藤合歡、南蛇藤果，東北地方習(xí)用藥材，常代替合歡花使用，為衛(wèi)矛科植物南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.的干燥果實(shí)。性味甘、平，具有舒郁、理氣、安神、活絡(luò)的作用，主治郁結(jié)胸悶，失眠，健忘，視物不清，咽痛，癰腫，跌打損傷疼痛等癥?；瘜W(xué)成分研究表明北合歡具有抑菌、鎮(zhèn)靜催眠、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制NF-kB活性的作用，具有潛在的藥用開發(fā)價(jià)值。北合歡是中成藥舒神靈膠囊、心舒膠囊、益心寧神片等處方中的組成藥味，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅載于《吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1977年版Ⅲ、《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2009年版。檢驗(yàn)項(xiàng)目為性狀、顯微鑒別、水分、灰分、浸出物，現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無法有效的控制北合歡的藥材質(zhì)量，本方法的建立，通過對(duì)照藥材比對(duì)進(jìn)行薄層色譜鑒別，HPLC法測(cè)定槲皮素、山柰素的含量控制藥材質(zhì)量。經(jīng)過不同產(chǎn)地采集的10批樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析制定各檢驗(yàn)項(xiàng)目限值，為更好的控制北合歡藥材的質(zhì)量提供科學(xué)的依據(jù)。

1.儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀：四元梯度泵，真空脫氣機(jī)，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，數(shù)據(jù)處理器；HH--4數(shù)顯叵溫水浴鍋（中國(guó)甄城華魯電熱電器有限公司山東）；薄層加熱板（瑞士卡瑪）；XS105電子天平（梅特勒一托利多儀器上海有限公司）；GZX-DH-26×30-TBS臺(tái)式電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；SX-G07103馬弗爐（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）。

甲醇（色譜純，美國(guó)生物），重蒸水（自制）。分析純甲醇、乙醚、乙醇、磷酸、鹽酸、硫酸、甲苯、乙酸乙酯、氫氧化鉀（北京化工廠）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，20140418）。藤合歡（南蛇藤果）對(duì)照藥材購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：121547-200501），槲皮素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：100081-200907），含量為96.2%；山柰素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110861-201310），含量為93.2%。10批樣品為產(chǎn)地收集，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張景龍鑒定為衛(wèi)矛科植物南蛇藤Celsius orbiculatus Thunb.的干燥果實(shí)。

2.方法與結(jié)果

2.1性狀

本品呈圓球形，果皮常開裂成三瓣，偶有四瓣，基部相連，易脫落，各果瓣長(zhǎng)約6～9mm，直徑6～7mm，鮮黃色至橙黃色，卵圓形，頂部有尖突起，內(nèi)面有一縱隔。每一果實(shí)有種子6粒，外被紅色肉質(zhì)假種皮，集成球形。剝?nèi)ゼ俜N皮可見卵形種子，表面灰棕色，光滑。氣清香，味苦、甘。

2.2鑒別

2.2.1顯微鑒別草酸鈣簇晶直徑10～50um，棱角稍尖或較鈍。草酸鈣方晶散在或分布在薄壁組織中。石細(xì)胞單個(gè)散在或數(shù)個(gè)成群，類圓形、長(zhǎng)方形或長(zhǎng)條形，有的末端較尖，層紋及紋孔明顯。螺紋、梯紋導(dǎo)管常見，細(xì)小。

2.2.2薄層色譜取本品粗粉1g，加氫氧化鉀甲醇溶液（氫氧化鉀10g，加甲醇20mL使溶解，加水定容至50mL）50mL，加熱回流45min，濾過，濾液加乙醚50mL振搖提取，取乙醚液用水洗滌3次，每次20mL，乙醚液蒸干，殘?jiān)右掖糽mL使溶解，作為供試品溶液。另取藤合歡（南蛇藤果）對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯一乙酸乙酯（9：4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1。

2.3檢查

水分以烘干法測(cè)定，10批結(jié)果為5.8%～9.9%。總灰分、酸不溶性灰分10批結(jié)果分別為4.7%～6.6%；0.2%～1.7%。二氧化硫殘留量10批結(jié)果為0～10mg/kg。鉛、鎘、砷、汞、銅10批結(jié)果分別為0.5～2.2mg/kg未檢出0.6～1.6mg&g、0.001～0.01mg/kg2.7～4.0mg，kg。9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量10批樣品均未檢出六六六、滴滴涕、五氯硝基苯農(nóng)藥殘留。

2.4浸出物

取本品，照四部通則2201項(xiàng)下醇溶性熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑，10批測(cè)定結(jié)果為27.5%～46.9%，平均33.6%。

2.5含量測(cè)定

2.5.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱AgilentZORBAX Eclipse Plus C₁₆ 5um 4.6mm×250mm，流動(dòng)相甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50），檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，進(jìn)樣量10uL，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500?；旌蠈?duì)照品溶液和供試品溶液的液相色譜圖見圖2、3。

2.5.2供試品溶液的制備取本品粉末（過三號(hào)篩）1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%鹽酸溶液一甲醇（1：6）的混合溶液100mL，稱定重量，加熱回流45min，冷卻至室溫，用上述溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.5.3對(duì)照品溶液的制備取槲皮素對(duì)照品、山柰素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL分別含12、25ug的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.5.4線性考察取槲皮素加甲醇制成每1mL含槲皮素0.I、0.5、1、5、10、50、100ug的溶液，以進(jìn)樣量（ug）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，槲皮素在進(jìn)樣量0.001～1ug范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，y=3847.7x+0.4811（r=1.0000）。

取山柰素對(duì)照品加甲醇制成每1mL含山柰素0.5、1、10、50、100、500、1000ug的溶液，以進(jìn)樣量（ug）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，山柰素在進(jìn)樣量0.005～10ug范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，y=4329.5x+84.852（r=0.9998）。

2.5.5精密度考察取本品粉末（過三號(hào)篩）1g，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，槲皮素和山柰素含量RSD分別為0.4%，0.1%。表明該方法精密度良好。

2.5.6穩(wěn)定性考察取本品粉末（過三號(hào)篩）1g，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別于0，4，6，8，12，24h測(cè)定槲皮素、山柰素含量，槲皮素和山柰素含量RSD分別為1.6%，1.3%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7重復(fù)性考察取本品粉末（過三號(hào)篩）1g，共6份，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，計(jì)算槲皮素、山柰素含量，槲皮素和山柰素含量RSD分別為1.3%，0.7%。表明供試品溶液重復(fù)性符合分析方法的要求。

2.5.8回收率考察取已知含量的供試品（過三號(hào)篩）1g，共6份，精密加入槲皮素、山柰素總量共2.844mg，照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，計(jì)算含量，回收率試驗(yàn)符合分析方法要求，結(jié)果見表1。

2.5.9樣品測(cè)定取10批供試品，分別照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

3.討論

因北合歡所含成分較復(fù)雜，種子內(nèi)含油脂類成分可達(dá)到50%，直接提取不利于色譜斑點(diǎn)的分離，故選擇以氫氧化鉀甲醇溶液分解油脂類成分，達(dá)到提純的效果，再以乙醚萃取，水洗乙醚液，乙醚液蒸干，得到易于觀察的薄層色譜特征?？疾炝瞬煌归_劑，甲苯一乙酸乙酯（9：4）、石油醚（60～90℃）一丙酮（3：1）、乙醚一氯仿（1：2），結(jié)果甲苯一乙酸乙酯（9：4）為展開劑時(shí)斑點(diǎn)顯色清晰，薄層色譜斑點(diǎn)間分離效果較好?？疾煺归_溫度（5～30℃），相對(duì)濕度（18%～88%），不同廠家生產(chǎn)的薄層板，均能得到清晰的色譜斑點(diǎn)，分離度較好，說明本方法耐用性較好。

通過10批檢驗(yàn)數(shù)據(jù)建議規(guī)定北合歡的水分檢查結(jié)果不得過12.0%，總灰分不得過8.0%，酸不溶性灰分不得過3.0%。

試驗(yàn)考察了水溶性浸出物（冷、熱）浸法、醇溶性浸出物（冷、熱）浸法，結(jié)果以醇溶性浸出物熱浸法所得含量較高。建議規(guī)定限值為按干燥品計(jì)，不得少于20.0%。

對(duì)鉛、鎘、砷、汞、銅、9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果含量均較低或未檢出，故考慮不列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

黃酮類為北合歡的主要成分，是一種很強(qiáng)的抗氧劑，可阻止細(xì)胞的退化、衰老。可以改善血液循環(huán)，降低膽固醇。黃酮的含量測(cè)定方法主要有分光光度法和高效液相色譜法，分光光度法操作簡(jiǎn)單，成本低，但誤差大。目前測(cè)定黃酮的主要方法是Hasler創(chuàng)立的高效液相色譜法，其原理是在鹽酸的作用下，將復(fù)雜的黃酮水解成槲皮素和山柰素，通過槲皮素和山柰素的含量得出總黃酮的含量。故選擇槲皮素和山柰素為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定。選擇槲皮素、山柰素均有較大吸收的360nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，在酸性條件下將總黃酮水解為槲皮素和山柰素，考察振蕩、超聲和回流提取法確定回流提取所得含量最高，考察不同提取溶劑量、提取時(shí)間，最終確定了提取方法。以流動(dòng)相甲醇0.4%磷酸（50：50）、甲醇一水一甲酸（44：55：1）、乙腈一水（40：60）進(jìn)行試驗(yàn)，均能得到較好的分離效果，考慮乙腈毒性較強(qiáng)，故選擇甲醇0.4%磷酸（50：50）為流動(dòng)相。流動(dòng)相酸性小范圍變動(dòng)時(shí)，對(duì)色譜峰的分離度和理論塔板數(shù)影響較小。流動(dòng)相比例在（50：50）±5范圍內(nèi)變動(dòng)時(shí)，含量結(jié)果無顯著差異。流速在0.8～1.2mL/min范圍內(nèi)變動(dòng)不影響檢測(cè)結(jié)果。柱溫在25—35℃范圍內(nèi)變動(dòng)時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小?？疾烊N不同廠家色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₀、島津Wonda CractODS-2、Waters SunFire C₁₀都能得到良好的分離度和理論塔板數(shù)，基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱性較好。通過10批樣品測(cè)定結(jié)果，建議含量測(cè)定限值為按干燥品計(jì)算，含總黃酮以槲皮素（c₁₅；H₁₀O₇）和山柰素（C₁₅；H₁₀O₆）的總量計(jì)，不得少于0.20%。