羌活提取物對熱敏通道TRPV1的影響?

劉珍洪，高 琳，汪文來，趙紅霞，高 蔚，安致君，郭 蓉，吳丹桐，Michael Xi Zhu，楊 楨△

(1. 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3.美國德克薩斯大學休斯頓健康科學中心，休斯頓，美國 77030)

【方藥研究】

羌活提取物對熱敏通道TRPV1的影響?

劉珍洪1，高 琳1，汪文來2，趙紅霞2，高 蔚1，安致君1，郭 蓉1，吳丹桐1，Michael Xi Zhu3△，楊 楨1△

(1. 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3.美國德克薩斯大學休斯頓健康科學中心，休斯頓，美國 77030)

目的：探討羌活水提物和醇提物對熱敏通道TRPV1的影響。方法：在瞬轉(zhuǎn)人源TRPV1的HEK293細胞上，運用膜片鉗技術(shù)測量羌活提取物對細胞跨膜電流的影響。結(jié)果：羌活提取物可激活TRPV1通道產(chǎn)生明顯的跨膜電流，該跨膜電流與TRPV1激動劑辣椒素誘發(fā)的電流在電流密度和電流-電壓關(guān)系各方面均類似；羌活水提物在生藥1 g/ml時稀釋10倍左右，對跨膜電流的影響達到最大，并可以被TRPV1競爭性抑制劑辣椒素完全阻斷。結(jié)論：羌活提取物中含TRPV1激動劑，該通道活化后產(chǎn)生的系列效應可能是羌活解表、止痛的重要分子機制。

羌活; 熱敏通道 TRPV1; 激動劑;解表;止痛

羌活是常用解表中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》中羌活與獨活不分，言其有“止痛”作用。唐·《新修本草》將羌活、獨活分列。唐·《藥性論》言羌活“味苦，辛”。羌活有濃郁的芳香氣味，《中藥學》將其功效概括為解表散寒、祛風濕、止痛，其藥性符合香草酸受體(TRPV1)激動劑的特征。TRPV1為具有鈣離子通透性的非選擇性陽離子通道，主要分布在屬于傷害性感受器類型的感受神經(jīng)元及其神經(jīng)末梢的細胞膜上。作為熱敏通道[1]，TRPV1在正常情況下主要為大于43°C的高溫所激活導致熱痛，同時也參與體溫調(diào)節(jié)。病理狀態(tài)下，組織酸化、身體發(fā)熱、多種炎癥因子的產(chǎn)生也能引起TRPV1通道的活化[2]，造成炎癥痛。作為介導外周疼痛的主要通道之一，TRPV1的激動劑常常是痛覺敏化劑，但也因敏化引起的脫敏而可以作為鎮(zhèn)痛劑?，F(xiàn)已證明，眾多辛味中藥和食品可以激活TRPV1通道，其中辣椒素(Capsaicin)是研究TRPV1最常用的激動劑。因此，TRPV1被稱為辣椒素受體。中醫(yī)臨床以及動物行為學已經(jīng)證明，羌活有很好的止痛作用[4-5]，然而其分子機制并不清楚，我們推測羌活可能通過TRPV1通道發(fā)揮藥效。本研究使用羌活的水提物和醇提物，在轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細胞上，使用膜片鉗技術(shù)，對細胞跨膜電流進行了測試，以確定羌活對TRPV1通道的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

中藥羌活(2016年3月購自北京同仁堂藥店)、TRPV1 plasmid(Origene，RC217653)、質(zhì)粒GFP(北京愛思益普生物科技股份有限公司)、DMEM cell culture medium、Fetal Bovine Serum、penicillin/streptomycin(Gibco)、Lipofectamine2000(invitrogen)、Capsaicin、Capsazepine、DMSO、Sodium chloride、Potassium chloride、Cesium chloride、EGTA、HEPES、Magnesium chloride hexahydrate、D-glucose、Calcium chloride(Sigma)。

1.2 儀器

EPC-10 Quattro膜片鉗放大器(Heka，德國)、PatchMaster數(shù)據(jù)獲取軟件(Heka，德國)、P-97拉制儀器(Sutter Instruments，美國)、IGOR-Pro分析軟件(WaveMetrics Inc，美國)、300克密封型搖擺式粉碎XL-06B(廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52(上海虹昕電子儀器儀表有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6(常州潤華電器有限公司)、SHZ-III型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 羌活提取物制備 75%乙醇提取物的制備：稱取80 g羌活用粉碎機粉碎成粉末，加入8倍量的75%乙醇與之混合，浸泡30 min，95℃恒溫水浴鍋上回流提取器回流提取2 h，冷卻至室溫后雙層濾紙過濾，收集濾液，剩余的藥渣用于再次提取。重復提取1次，合并2次提取的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上回收乙醇，所得的膏狀物(不含乙醇)用雙蒸水調(diào)濃度至2 g/ml分裝，-20℃避光保存?zhèn)溆?。實驗時用細胞外液稀釋100倍(即20 mg/ml)。水提物的制備：稱取50 g羌活加8倍量雙蒸水浸泡30 min，大火加熱至沸騰，文火保持微沸30 min，待冷卻后傾出藥汁，剩余的藥渣加5倍量雙蒸水再次煎煮，合并2次藥汁雙層濾紙過濾，99℃恒溫水浴鍋加熱濃縮調(diào)濃度為1 g/ml，3500 r/min離心15 min后取上清液即得羌活水提物，分裝，-20℃避光保存?zhèn)溆?。實驗時用細胞外液按照1∶5、1∶10、1∶20的濃度進行稀釋。

1.3.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染(HEK293/TRPV1) 本實驗所用細胞株為人胚腎293細胞(Human Embryonic Kidney 293 cells，HEK293)。質(zhì)粒是根據(jù)GenBank所載基因信息構(gòu)建：Homo sapiens transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 1 (TRPV1)，transcript variant 1，GenBank 的保藏號NM_080704.2。細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前24 h將細胞植于直徑12 mm細胞爬片中并置于細胞培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前換為不含抗生素的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中預熱。將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，質(zhì)粒與稀釋液DMEM在室溫下平衡15 min至20℃左右，使用無血清的DMEM將轉(zhuǎn)染試劑稀釋至終濃度為5 μL轉(zhuǎn)染試劑/100 μL DMEM，使用無菌管稀釋輕柔混勻。將2 μg TRPV1質(zhì)粒和600ng GFP質(zhì)粒共同加入100 μL轉(zhuǎn)染試劑稀釋液中，輕柔混勻后將轉(zhuǎn)染試劑、DNA復合物于15～20℃下靜置15 min。從培養(yǎng)箱中取出預熱的細胞培養(yǎng)皿，將轉(zhuǎn)染試劑、DNA復合物逐滴加入，轉(zhuǎn)染后4 h換成完全培養(yǎng)基(無雙抗)，孵育細胞24～72 h內(nèi)進行電生理檢測。

1.3.3 全細胞膜片鉗實驗 實驗在室溫20～25℃下進行，將細胞爬片放置于專門的記錄小室中，固定浴液電極。顯微鏡下選取外形完整、形狀規(guī)則、邊緣整齊、表面光滑無顆粒、橫紋清晰、無收縮的長桿狀細胞。膜片鉗放大器系統(tǒng)通過A/D和D/A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器與計算機進行連接，PatchMaster軟件控制相關(guān)的刺激信號以及電流、電壓信號的采集。玻璃微電極拉制儀拉制玻璃毛胚成尖端直徑1～1.5 μm的玻璃微電極，灌入電極內(nèi)液后安裝于電極夾持器上與探頭和放大器聯(lián)通。顯微鏡觀察下用三維操縱儀調(diào)節(jié)電極尖端的位置使其移向細胞表面，輕壓細胞微變形，1 ml注射器負壓吸引封接細胞，形成高阻封接(Giga seal)至1 GΩ以上，完成封接后進行電極電容補償。觀察1～2 min，如果不能自行破膜則用1 ml注射器負壓吸引破膜，形成全細胞的記錄模式。對全細胞膜電容進行補償后給予相應的測試程序進行信號采集。采樣頻率為10 kHz。

電極內(nèi)液成分為CsCl 140 mmol/L， CaCl25 mmol/L， ATP-Mg 1 mmol/L， HEPES 10 mmol/L， EGTA 10 mmol/L， MgCl22 mmol/L，用CsOH 調(diào)至pH值 7.2。自由Ca2+濃度維持在85 nmol/L。電極外液成分為NaCl 140 mmol/L， KCl 5 mmol/L， MgCl22 mmol/L， CaCl22 mmol/L， HEPES 10 mmol/L， glucose 5 mmol/L，用NaOH 調(diào)至pH 7.4。細胞維持電壓(holding potential,Vhold)設(shè)定為-80 mV，在Vhold的基礎(chǔ)上間隔1 s給予細胞一個從-100 mV到+100 mV連續(xù)電壓斜坡(voltage ramp)刺激(圖1-B)或-80 mV電壓下連續(xù)記錄。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 羌活醇提物對TRPV1轉(zhuǎn)染HEK293細胞的影響

圖1顯示，在對羌活75%乙醇提取物的研究中，將羌活醇提物用正常TRPV1細胞外液按1∶100稀釋，測試羌活醇提物(20 mg/ml)對表達TRPV1細胞跨膜電流的影響，細胞外液為陰性對照，1 μmol/L辣椒素(capsaicin)引起的電流作為陽性對照。實驗時先加細胞外液觀察電流的基線水平，穩(wěn)定后滴加測試樣品，當電流達到峰值下降后用細胞外液進行洗脫(wash)，使電流恢復至給藥前狀態(tài)(基線水平)，最后滴加陽性藥1 μmol/L辣椒素對比其誘導的跨膜電流(圖1-A)。細胞電容(pF)代表細胞的大小，每個細胞的大小不一，故數(shù)據(jù)統(tǒng)計用+100 mV電壓下電流密度(=跨膜電流/細胞電容)(pA/ pF)。電流增大倍數(shù)=測試樣品跨膜電流/細胞外液基底跨膜電流。對辣椒素活性百分比(%)=測試樣品跨膜電流/辣椒素跨膜電流100%。結(jié)果顯示，與正常細胞外液比較，羌活醇提物能誘導表達TRPV1細胞產(chǎn)生明顯的跨膜電流(圖1-C，羌活醇提物，206±47 pA/pF，n=10，細胞外液，57.6±7.2pA/pF;n=10；P<0.01)。羌活醇提物誘導的電流增大倍數(shù)為(3.4±0.6,圖1-D，n=10，P<0.01)，是1 μmol/L辣椒素誘導的電流增大倍數(shù)(7.9±1.2，n=10，P<0.001)的一半左右。在與1 μmol/L辣椒素誘導的跨膜電流比較中發(fā)現(xiàn)，羌活醇提物誘導的電流與細胞外液中檢測到的基底跨膜電流存在明顯差異(圖1-E，羌活醇提物60±14，細胞外液(20±7%，P<0.01)。綜上，羌活醇提物具有激活熱敏通道TRPV1產(chǎn)生跨膜電流的效應。

圖1 羌活醇提物與辣椒素對轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細胞全細胞電流影響注：A.+100 mV(空心點)和-100 mV(實心點)電壓下跨膜電流時程圖。a、b、c顯示圖B中電流-電壓(I-V)曲線代表的時間點；B.在細胞外液(a)、羌活醇提物峰值b、辣椒素峰值c點用電壓斜坡(voltage ramp)檢測到的I-V關(guān)系曲線；C-E.各組+100 mV電壓下電流密度(C)、電流增大倍數(shù)(D)和E對辣椒素活性百分比(E)統(tǒng)計圖(Mean±SEM)；組間比較：**P<0.01，***P<0.001

2.2 羌活水提物濃度效價以及辣椒平對其抑制作用

圖2、3顯示，在對羌活水提物的研究中，將羌活水提物與細胞外液按1∶5、1∶10和1∶20的比例稀釋，測試這3個濃度羌活水提物對表達TRPV1的HEK293細胞跨膜電流的影響。結(jié)果顯示，1∶10稀釋即可產(chǎn)生最大的跨膜電流。在稀釋到1∶20的時候，跨膜電流已經(jīng)非常小。為進一步證明水提物對TRPV1的作用，使用TRPV1的競爭性拮抗劑辣椒平(10 μmol/L)與羌活水提物同用，證明可完全抑制同一稀釋濃度羌活水提物(1∶10)誘導的跨膜電流。

圖2 羌活水提物3個不同稀釋濃度在同一細胞與辣椒素(30 M)誘導的跨膜電流比較注：圖示-80 mV電壓下連續(xù)記錄的跨膜電流時程。

圖3 TRPV1通道競爭性拮抗劑辣椒平(capsazepine)完全阻斷了羌活水提物(1∶10稀釋)誘導的跨膜電流注：-80 mV電壓下連續(xù)記錄

3 討論

羌活是辛溫解表藥且“氣味雄烈”，功效為祛風勝濕止痛。行為學研究證實，羌活有很好的止痛作用[6-9]。本研究使用羌活水提、醇提物嘗試了解羌活的可能分子靶點。膜片鉗數(shù)據(jù)顯示，羌活混合物具有明確的TRPV1激動劑效應，該效應能夠被TRPV1的競爭性拮抗劑阻斷，因此羌活中含有明確的TRPV1受體激動劑成分。

前期的研究中我們已經(jīng)討論了TRPV1通道對惡寒發(fā)熱的影響機制[10]。惡寒發(fā)熱涉及到體溫變化。人體溫度調(diào)節(jié)由一個多傳感器、多效應器的系統(tǒng)完成[11-12]。體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)發(fā)揮整體功效由相互獨立的多個效應器環(huán)相互協(xié)調(diào)完成，每一個熱效應器環(huán)都是由1個惟一的傳入神經(jīng)通路和受其支配的感受器構(gòu)成[13]，而TRPV1在啟動這類熱效應器時發(fā)揮主導作用[12-14]。辛味中藥產(chǎn)生的溫熱感可以直接抵抗環(huán)境或感染誘發(fā)的寒戰(zhàn)，現(xiàn)以證明不少辛味中藥對TRPV1有激動效應。在疼痛感知方面，瞬時受體電位(TRP)離子通道家族的3個成員即TRPV1、TRPM8和TRPA1 是寒熱和化學刺激激活感覺神經(jīng)元產(chǎn)生急性或持續(xù)性疼痛的分子探測器，這些受體的激動劑或抑制劑在止痛方面發(fā)揮著重要作用[15]。

在濃度與藥效的關(guān)系方面，本研究使用水提物的3個不同濃度對跨膜電流的影響顯示，在室溫下峰值電流在1∶10左右最大，當濃度稀釋達到1∶20的時候，跨膜電流幾乎消失。但有鑒于TRPV1為熱敏感通道，其對激動劑的敏感度會隨著溫度提高而增加許多，因此在正常體溫下激活TRPV1通道對于羌活的濃度要求應該會低很多。

基于目前對TRPV1的研究，我們已經(jīng)可以很好地理解《中藥學》中的羌活以及《方劑學》中含羌活方劑的功用。以目前《方劑學》教材為例，在敗毒散、九味羌活湯、羌活勝濕湯和川芎茶調(diào)散等4個使用羌活的方劑中，作為湯劑使用，羌活的推薦用量是6～10 g。以水煎劑400 ml每天計算，羌活的生藥濃度在1∶40～1∶67之間。以此推斷，羌活在方劑中極有可能單獨發(fā)揮作用，但也不排除需賴于其他藥物的協(xié)同作用。這種協(xié)同性在相須配伍的方式中可能體現(xiàn)在辛味相近的中藥中含有一樣的化學成分，多藥同用的時候形成量的疊加，進而發(fā)揮應有作用。相須配伍的另外一個方式，可能就是多種化學成分作用于同一靶點。以TRPV1通道的激動劑為例，前者如川芎、藁本都含川芎內(nèi)酯，后者如吳茱萸和生姜所含的不同成分都是TRPV1受體激動劑。

敗毒散是重要的解表劑，主治氣虛外感證，可見“憎寒壯熱”，羌活、獨活是其君藥。惡寒發(fā)熱是表證的特征性癥狀，除敗毒散外，九味羌活湯也是治療外感風寒濕而致身疼痛的重要方劑。《方劑學》中另外還有川芎茶調(diào)散、大秦艽湯、羌活勝濕湯含有羌活，它們都發(fā)揮祛風濕止痛的作用?，F(xiàn)具有批準文號的中成藥中，含羌活的處方有441個之多，基本上屬于解表、退熱、祛風濕、止痛類[16]。TRPV1在感染性疾病惡寒、發(fā)熱的途徑中發(fā)揮著重要作用[10]，羌活活化TRPV1可能是敗毒散等方藥解表作用實現(xiàn)的重要途徑之一。

在本研究中，我們首先報道羌活的水提物和醇提物都能激活TRPV1，在細胞和分子層面上對羌活的藥效有了進一步的了解。羌活含有眾多的化學成分[17]，2010版《中國藥典》將羌活中的羌活醇和異歐前胡素含量作為羌活飲片的質(zhì)控標準。在這些化學成分中，尚無文獻記載單體活性成分可以活化TRPV1通道。在類似的結(jié)構(gòu)中，與羌活功效類似的白芷，其含有主要藥性成分歐前胡素(Furanocoumarin imperatorin)，能夠活化TRPV1通道。進一步膜片鉗證據(jù)顯示，羌活中存在未經(jīng)報告的激動劑(數(shù)據(jù)待發(fā))。

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Effects of Notopterygium Incisum Extracts on the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 of Thermosensitire Channel

LIU Zhen-hong1, GAO Lin1, WANG Wen-lai2, ZHAO Hong-xia2, GAO Wei1, AN Zhi-jun1, GUO rong1, WU Dan-tong1, Michael Xi Zhu3Δ, YANG Zhen1Δ
(1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2.InstituteofBasicTheory,ChinaAcademyofTraditionalChineseMedicalSciences,Beijing100700,China; 3.DepartmentofIntegrativeBiologyandPharmacology,UniversityofTexasHealthScienceCenteratHouston,Houston,TX77030,USA)

Objective: To investigate the effect of ethanol extracts and water extracts ofNotopterygiumincisum on thermosensitive channel, Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1). Methods: Whole cell voltage clamp technique was used to record transmembrane currents induced by theNotopterygiumextracts in HEK 293 cells that expressed human TRPV1. Results: Both ethanol and water extracts ofNotopterygiumincisum evoked robust currents comparable to that by the known TRPV1 agonist, capsaicin, in current density and current-voltage relationship. The maximum effect ofNotopterygiumwater extracts was reached at 100 mg/ml. TheNotopterygium-inducedTRPV1 current was completely abolished by the specific TRPV1 antagonist, capsazepine (10 μM). Conclusions: One or more components ofNotopterygiumextracts are TRPV1 agonists, which may underlie the analgesic and relieving exterior syndrome effects ofNotopterygium. Key words:Notopterygiumincisum; Thermosensitive channel; TRPV1; Relieving exterior syndrome; analgesic

國家自然科學基金面上項目(81573847)-基于熱敏通道的交叉脫敏探討理中丸、小建中湯和吳茱萸溫中散寒功效的共同作用機制；北京中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項目(JJ2015-56)-基于寒痛通道TRPA1的吳茱萸桂枝對宮寒小鼠的子宮容受性影響研究；北京市“3+3”李慶業(yè)名老中醫(yī)工作站(2009-JC-31)；中國中醫(yī)科學院自主選題項目(YZ-1316)-補腎化痰散瘀法治療多囊卵巢綜合證的機理探討

R284.2

B

1006-3250(2017)04-0553-05

2016-10-14

△通訊作者：Michael Xi Zhu，男，教授，從事細胞信號與離子通道的研究，E-mail:Michael.x.zhu@uth.tmc.edu;楊 楨，男，教授，從事中醫(yī)處方法、辛味中藥的藥效研究,Tel：010-64286992,E-mail：for3000yz@aliyun.com。