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      加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素大鼠腎臟保護(hù)及自噬水平的調(diào)控作用?

      2017-06-01 12:20:41于子凱王金虎趙晉寧
      關(guān)鍵詞:米沙坦阿霉素腎臟病

      于子凱,楊 斌,張 昱,王金虎,張 秋,郝 偉,趙晉寧

      (中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京 100091)

      【實(shí)驗(yàn)研究】

      加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素大鼠腎臟保護(hù)及自噬水平的調(diào)控作用?

      于子凱,楊 斌,張 昱△,王金虎,張 秋,郝 偉,趙晉寧

      (中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京 100091)

      目的:觀察加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)的影響。方法:設(shè)立空白、模型、替米沙坦及加味黃芪赤風(fēng)湯組,光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化,免疫組化法檢測(cè)FN、LN、LC3和Beclin-1的表達(dá)及分布。結(jié)果:加味黃芪赤風(fēng)湯可保護(hù)阿霉素腎病大鼠腎臟,顯著抑制腎組織中的FN、LN,顯著拮抗自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1的過度表達(dá)。結(jié)論:加味黃芪赤風(fēng)湯通過調(diào)控自噬水平對(duì)阿霉素腎病大鼠腎臟起到保護(hù)作用。

      加味黃芪赤風(fēng)湯;自噬;阿霉素腎?。坏鞍啄?/p>

      蛋白尿是慢性腎臟病的主要臨床表現(xiàn),長(zhǎng)期蛋白尿可加速腎臟病的進(jìn)展,是慢性腎臟病發(fā)展為腎衰竭的重要因素[1]。自噬( autophagy) 是在環(huán)境壓力條件下細(xì)胞保持存活高度保守的體內(nèi)平衡機(jī)制,是細(xì)胞依賴溶酶體途徑對(duì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種過程,為細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)[2-3]。Fougeray S等研究表明,在腎臟病防治方面,自噬可作為新的作用靶點(diǎn)[4]。從中醫(yī)藥治療角度對(duì)自噬進(jìn)行相關(guān)研究可為腎臟病蛋白尿的防治提供全新的線索及思路。加味黃芪赤風(fēng)湯是張昱主任醫(yī)師創(chuàng)制的治療慢性腎臟病蛋白尿的有效方劑。前期研究表明,加味黃芪赤風(fēng)湯能夠明顯改善阿霉素腎病大鼠蛋白尿,保護(hù)腎功能,提高抗自由基能力,改善腎臟自由基損傷,并能夠提高血清一氧化氮(nitric oxide,NO)含量,降低血清內(nèi)皮素(endothelin-1,ET-1)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth Factor-β1,TGF-β1)含量,對(duì)延緩腎小球硬化及腎臟纖維化的發(fā)展有積極意義[5-6]。本實(shí)驗(yàn)以阿霉素腎病大鼠為研究對(duì)象,研究加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)腎臟組織的保護(hù)作用及其對(duì)自噬相關(guān)蛋白(light chain 3,LC3)和Beclin-1的影響,為加味黃芪赤風(fēng)湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料

      1.1 動(dòng)物

      健康雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量(220±18)g,月齡2~3個(gè)月,購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司,于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng),所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

      1.2 藥品與試劑

      加味黃芪赤風(fēng)湯組成:生黃芪30 g, 芡實(shí)、金櫻子各20 g, 赤芍、防風(fēng)、地龍、白花蛇舌草各10 g,生藥飲片由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科鑒定。替米沙坦,即美卡素Boehringer Ingelheim International GmbH生產(chǎn)(進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20090416,H20090417),注射用鹽酸多柔比星(速溶性)PfizerItalia s.r.l.生產(chǎn)(進(jìn)口藥品注冊(cè)號(hào)H20080278,進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)Jx20000016),免疫組化抗體由abcam公司生產(chǎn)(貨號(hào)分別為ab52167,ab32351),二抗(PV-6000)通用型二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

      1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

      ES-1100型電子天平(長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司),TB-718型生物組織包埋機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司),RM2235型組織切片機(jī)(德國(guó)Leica),HI1220型烤片機(jī)(德國(guó)Leica),ST5020型全自動(dòng)組織脫水機(jī)(德國(guó)Leica),Olympus-bx51型顯微鏡(日本),Anymicro DSSTM型圖像分析儀(北京裕天世紀(jì)偉業(yè)科技有限公司),轉(zhuǎn)移電泳槽(BIO-RAD公司),垂直板電泳槽(BIO-RAD公司),PowerPacTM通用型電源(BIO-RAD公司),脫色搖床(TS-1型,江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠),電子分析天平(AE240型,METTLER公司),37℃水浴箱(北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司),冷凍離心機(jī)(MIKRO022R,LABWAY science公司),制冰機(jī) (F100,LABWAY science公司),ChemicDocTM XRS+ Image LabTM凝膠圖像分析管理系統(tǒng)(BIO-RAD公司),-70℃超低溫冰箱(Jauan VxE 380)。

      2 方法

      2.1 造模與分組

      實(shí)驗(yàn)第1天,將SD大鼠隨機(jī)分為空白組10只與阿霉素腎病組30只。空白組尾靜脈一次性注射等量生理鹽水,并每日灌服等體積生理鹽水;阿霉素腎病組采用尾靜脈一次性注射阿霉素6.2 mg/kg的方法造模[7],2周后用干化學(xué)法測(cè)定大鼠小便中的尿蛋白。造模成功標(biāo)準(zhǔn):大鼠尿蛋白呈(++++)為造模成功,經(jīng)過檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)造模成功,再將阿霉素腎病大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組各10只。其中模型組10只,每日灌服等體積生理鹽水;正常劑量加味黃芪赤風(fēng)湯組10只,每日按生藥11.46 g/kg以水煎劑灌服;替米沙坦組10只,每日按8.33 mg/kg灌服替米沙坦混懸液。各組灌服均從造模后第2周末開始,持續(xù)至實(shí)驗(yàn)第8周末結(jié)束。

      2.2 觀察指標(biāo)及方法

      2.2.1 光鏡檢測(cè)腎組織病理結(jié)構(gòu)變化 在第8周末處死大鼠后迅速手術(shù)剝離腎臟取腎皮質(zhì),用10%甲醛固定、石蠟包埋,HE、PASM及Masson分別染色,制成薄切片用于光鏡檢查,其余腎皮質(zhì)保存于-70℃冰箱。

      2.2.2 免疫組化染色法 檢測(cè)纖維連接蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)、層黏連蛋白(laminin,LN)、LC3及Beclin-1的定位及分布。二甲苯脫蠟,高壓熱修復(fù),降至室溫,PBS洗后滴加一抗,4℃冰箱過夜,室溫放置30 min后PBS洗滴加二抗,室溫放置30 min,PBS洗后室溫DAB顯色,顯微鏡下觀察目標(biāo)出現(xiàn)陽性后蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,氨水返藍(lán),中性樹膠封片,圖像采集并分析,以免疫組織化學(xué)染色陽性信號(hào)累積光密度(IOD)作為組織表達(dá)的定量標(biāo)準(zhǔn)。IOD=平均光密度(AOD)× 陽性面積(A)。

      2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

      3 結(jié)果

      3.1 腎組織病理結(jié)構(gòu)改變

      圖1顯示,空白組腎組織經(jīng)HE、PAS、MASSON染色后光鏡下可見,腎小球結(jié)構(gòu)清晰完整,球囊比例正常,小球內(nèi)未見系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生,腎小管排列有序,小管上皮細(xì)胞如常。模型組則出現(xiàn)腎小球毛細(xì)血管球擴(kuò)張,系膜細(xì)胞增生,系膜基質(zhì)明顯增多,局部毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)塌陷;腎小管排列紊亂,囊性擴(kuò)張,小管上皮細(xì)胞變性,基底膜增厚。加味黃芪赤風(fēng)湯組及替米沙坦組腎小球和腎小管病變均有不同程度的減輕。

      圖1 各組大鼠腎臟病理變化

      3.2 腎組織中FN、LN、Beclin-1及LC3的表達(dá)與分布

      圖2表1顯示,F(xiàn)N、LN均為漿表達(dá),表達(dá)于腎小球系膜基質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞周圍基底膜。與空白組比較,模型組腎組織中FN、LN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,加味黃芪赤風(fēng)湯組腎組織中FN、LN蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);LC3為漿、核表達(dá),表達(dá)于腎小球和腎小管上皮細(xì)胞中,Beclin-1為漿表達(dá),主要表達(dá)于腎小球,與空白組比較,模型組腎組織中LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,加味黃芪赤風(fēng)湯組及替米沙坦組腎組織中LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

      圖2 各組大鼠腎臟組織中FN、LN、Beclin-1及LC3免疫組化染色分布圖

      組 別鼠數(shù)FNLNLC3Beclin?1空白組10880 30±65 56970 60±39 871200 35±65 30950 23±65 30模型組101800 35±43 80▲1700 50±61 30▲2500 63±60 86▲1800 29±40 32▲加味黃芪赤風(fēng)湯組101200 28±68 00△1288 76±39 67△1535 65±39 87△1105 36±60 95△替米沙坦組101288 76±43 96△1360 36±58 97△1596 80±60 56△1196 76±63 70△

      注:與空白組比較:▲P<0.05;與模型組比較:△P<0.05

      4 討論

      加味黃芪赤風(fēng)湯出自清·王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中的黃芪赤風(fēng)湯,是張昱主任醫(yī)師在對(duì)慢性腎臟病蛋白尿“虛、瘀、毒、風(fēng)”復(fù)雜病機(jī)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上將其加減化裁而成。方中重用生黃芪健脾益氣,赤芍活血化瘀,芡實(shí)、金櫻子健脾升清、補(bǔ)腎固精,穿山龍、防風(fēng)祛除腎絡(luò)風(fēng)邪,白花蛇舌草清熱解毒,全方共奏補(bǔ)腎健脾、祛風(fēng)解毒、活血化瘀之功,臨床應(yīng)用加味黃芪赤風(fēng)湯治療慢性腎臟病蛋白尿療效顯著[8]。

      FN及LN是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,F(xiàn)N可以同時(shí)與細(xì)胞外基質(zhì)各類成分相結(jié)合,并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)其他成分沉積,LN可以引起細(xì)胞黏附并影響基底膜的電荷選擇性[9],二者在纖維化的早期即可形成并廣泛沉積,是觀察組織纖維化的常用指標(biāo)[10]。本研究觀察到,加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素大鼠腎臟病理有明顯改善及保護(hù)作用,同時(shí)通過抑制FN及LN蛋白的表達(dá)抗腎小球硬化。

      自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制,自噬通過清除長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器,在腎臟處理各種應(yīng)急的病理生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵保護(hù)作用,但是自噬的過度表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞器的受損[11]。研究顯示[12],通過特異性敲除足細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5,模擬構(gòu)建了自噬缺乏的衰老足細(xì)胞的模型,高齡小鼠自噬功能被過度抑制,導(dǎo)致體內(nèi)氧化蛋白蓄積,出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并表現(xiàn)蛋白尿,最終導(dǎo)致足細(xì)胞損傷丟失及腎小球硬化。一旦自噬活性持續(xù)亢奮,可加劇腎臟損傷,可見自噬是一把雙刃劍,過度表達(dá)或高度抑制均可對(duì)腎臟造成病理損傷[13-14]。Beclin-1[15]在細(xì)胞自噬途徑相互交流和協(xié)調(diào)的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其可通過將自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡中,參與到自噬體形成的整個(gè)過程中,在自噬體的成熟過程中,Beclin-1同樣扮演著重要角色。LC3可作為自噬體形成的標(biāo)志一直存在于自噬體中。本研究結(jié)果表明,與空白組比較,模型組大鼠腎臟組織中Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)水平較顯著升高。該結(jié)果表明,阿霉素誘導(dǎo)大鼠腎臟過度自噬從而引起腎臟病理損傷,而加味黃芪赤風(fēng)湯與替米沙坦也能不同程度地提高Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá)。但是與模型組比較,加味黃芪赤風(fēng)湯與替米沙坦均能不同程度地拮抗Beclin-1、LC3蛋白的過度表達(dá)??梢?,在一定程度上調(diào)Beclin-1、LC3蛋白的表達(dá),減少腎臟病理損傷,但是Beclin-1、LC3蛋白的過度表達(dá)可加重腎臟病理損傷。本研究結(jié)果表明,加味黃芪赤風(fēng)湯可提高自噬基礎(chǔ)活性并維持自噬活性處于平衡狀態(tài),進(jìn)而保護(hù)腎臟組織,減少腎臟病理損傷。

      [1] CHITRA PS,SWATHI T,SAHAY R,et al. Growth hormone induces transforming growth factor-beta-induced protein inpodocytes:implications for podocyte depletion and protein-uria[J]. J Cell Biochem,2015,116(9):1947-1956.

      [2] 于子凱,李劉生,張昱. 自噬與PI3K-AKT/mTOR信號(hào)通路在足細(xì)胞損傷中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016,13(9):84-87.

      [3] JEREMY S,LEVENTHAL,JOHN C,et al. Autophagy and Immune Re-sponse in Kidneys[J].Seminars in Nephrology,2014,34 ( 1 ) : 53-61.

      [4] FOUGERAY S,PALLET N.Mechanisms and biological functions of autophagy in diseased and aging kidneys[J].Nat rev Nephrol,2015,11(1):34-35.

      [5] 王允亮,張昱,王洪霞,等.加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素腎病大鼠蛋白尿及腎臟皮質(zhì)SOD、MDA 的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2011,17(5):505-506.

      [6] 王允亮,張昱,王洪霞,等.加味黃芪赤風(fēng)湯對(duì)阿霉素腎病大鼠蛋白尿及血清NO、ET-1和TGF-β1的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(10):852-854.

      [7] 張勇,張蓓,寧華英,等. 單次尾靜脈注射法阿霉素大鼠腎病模型的建立[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2013,219(1):1-4.

      [8] 張昱.加味黃芪赤風(fēng)湯治療慢性腎炎蛋白尿 50 例臨床觀察[J].中醫(yī)中藥,2007,4(36) :137.

      [9] 李夢(mèng),李鳳婷,耿建國(guó). 消渴康對(duì)DN大鼠腎臟FN、LN、Ⅳ膠原表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2012,1:53-54.

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      Protective Effect of Modified Huangqi Chifeng Decoction on Adriamycin Nephrosis(AN) Rats kidney and Its Regulated Effect on Its Autophagy level

      YU Zi-kai, YANG Bin, ZHANG Yu△,WANG Jin-hu,ZHANG Qiu,HAO Wei,ZHAO Jin-ning
      (XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China)

      Objective:To explore the effect of Modified Huangqi Chifeng Decoction on adriamycin nephrosis(AN) rats and its effect on the expression of LC3 and Beclin-1.Methods:To set up blank、model、Telmisartan and Modified Huangqi Chifeng Decoetion group.The changes of kidney tissue pathology were detected after light microscopy. The localization and distribution of FN、LN、LC3 and Beclin-1were detected by Immunohistochemical staining.Results:Modified Huangqi Chifeng Decoction can protect kidney tissue pathology,significantly restrain the expression of FN and LN,significantly restrain the expression of the autophagy-related proteins LC3 and Beclin-1. Conclusion:Modified Huangqi Chifeng Decoction can protect kidney tissue pathology through regulating the autophagy level.

      Modified HuangqiChifeng Decoction;Autophagy;Adriamycin nephrosis;Proteinuria

      中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項(xiàng)目(ZZ0708105)-加味黃芪赤風(fēng)顆粒治療慢性腎臟病(1-2期)蛋白尿的療效及其機(jī)理研究

      于子凱(1990-),男,河南鄭州人,在讀碩士,從事中西醫(yī)結(jié)合慢性腎臟病的防治與研究。

      △通訊作者:張 昱(1965-),男,北京人,主任醫(yī)師,教授,醫(yī)學(xué)博士(后),博士研究生導(dǎo)師,從事中醫(yī)腎臟病的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mail:zhangyu8225@163.com。

      R285.5

      B

      1006-3250(2017)04-0477-03

      2016-10-21

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