CTLA-4(AT)n多態(tài)性與過敏性紫癜的相關(guān)性研究

侯紅紅，賀改濤，劉 麗，黃燕萍

(1.西安市中心醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

CTLA-4(AT)n多態(tài)性與過敏性紫癜的相關(guān)性研究

侯紅紅1，賀改濤2，劉 麗2，黃燕萍2

(1.西安市中心醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

目的 探討細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)(AT)n多態(tài)性與兒童過敏性紫癜的相關(guān)性。方法 選取2014年1月至2015年12月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院診斷為過敏性紫癜的患兒60例為病例組，另選取健康普查的30例健康兒童作為對照組。采用ABI3130xl測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳對第4外顯子3′端的AT重復(fù)序列進(jìn)行基因分型。分析微衛(wèi)星的等位基因頻率在各組間的分布。結(jié)果 ①微衛(wèi)星(AT)n在病例組和對照組共檢出等位基因19種，AT重復(fù)次數(shù)5～34不等，當(dāng)AT重復(fù)次數(shù)為16時，等位基因頻率在病例組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034，OR=2.115，95%CI：1.049～4.267)；②微衛(wèi)星(AT)n按有無腎臟損害分層：各等位基因頻率在有腎臟損害的過敏性紫癜(HSPN)組與無腎臟損害的過敏性紫癜(NHSPN)組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；③微衛(wèi)星(AT)n按性別分層：當(dāng)AT重復(fù)次數(shù)為15時，等位基因頻率在男女兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014，OR=0.210，95%CI：0.055～0.805)。結(jié)論 CTLA-4(AT)n基因多態(tài)性與過敏性紫癜(HSP)發(fā)病相關(guān)，AT基因重復(fù)次數(shù)為16時可能為HSP發(fā)病的易感基因，重復(fù)次數(shù)為15時可能為女性HSP患兒發(fā)病的易感基因。

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4；基因多態(tài)性；過敏性紫癜；兒童

過敏性紫癜又稱亨-舒綜合征(Henoch-Schonlein Purpura，HSP)，是兒童時期常見的系統(tǒng)性血管炎性疾病，其基本病變?yōu)閺V泛性無菌性小血管炎，以毛細(xì)血管壁炎性反應(yīng)為主，毛細(xì)血管脆性和通透性增加，血漿及血細(xì)胞滲出，引起皮膚、黏膜以及內(nèi)臟器官等多部位水腫、出血。該病病理改變?yōu)檠鼙谀[脹和壞死，血小板血栓形成，較重者可見壞死性小動脈炎。HSP的臨床特征為皮膚紫癜、消化道癥狀、關(guān)節(jié)炎及腎臟損害，少數(shù)可累及到神經(jīng)系統(tǒng)和肺部，累及腎臟而出現(xiàn)蛋白尿和(或)血尿，稱為紫癜性腎炎(henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN)。該病好發(fā)于學(xué)齡期兒童，常見發(fā)病年齡為3～10歲，一年四季均有發(fā)病，冬春季節(jié)發(fā)病較多，夏季較少。

自HSP被描述以來已有兩個世紀(jì)之久，學(xué)者們對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了不斷探索，但目前仍未完全清楚，普遍認(rèn)為免疫紊亂是其發(fā)病的關(guān)鍵，包括體液免疫、細(xì)胞免疫及免疫分子的參與?；颊唧w內(nèi)CD4+/CD8+及Th1/Th2比值發(fā)生異常，導(dǎo)致T細(xì)胞功能紊亂，多種免疫分子分泌異常，B細(xì)胞多克隆活化，促使免疫球蛋白分泌增多，尤其是IgA，IgA免疫復(fù)合物沉積于皮膚、內(nèi)臟血管內(nèi)皮及腎臟組織，引起血管損傷出血及腎臟損害，出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀[1]。流行病學(xué)研究提示，HSP具有遺傳易感性，該病發(fā)病具有有一定家族聚集性，家族中常見聚集傾向，同胞中可見先后發(fā)病者[2]。隨著基因水平研究技術(shù)的提高和深入，學(xué)者們對于HSP與基因的研究也越來越多。

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte associated ant igen-4，CTLA-4)又名CD152，是免疫球蛋白超家族成員，在激活的T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，其不僅對T細(xì)胞活化起負(fù)向調(diào)節(jié)作用，還可調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化[3]，維持機(jī)體T細(xì)胞相關(guān)的免疫平衡，故可推測CTLA-4功能異常會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，包括HSP。

人類CTLA-4基因位于2q33，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，緊接外顯子4的是一段UTR，其中包括一段(AT)n重復(fù)序列，AT重復(fù)次數(shù)較多者，其個體T細(xì)胞反應(yīng)性會隨之增強(qiáng)，mRNA的穩(wěn)定性降低，降解速度增快，CTLA-4蛋白表達(dá)水平下降，導(dǎo)致這些個體發(fā)生自身免疫性疾病的易感性增加；相反，AT重復(fù)次數(shù)較少者，其個體可以表達(dá)高水平CTLA-4，保護(hù)機(jī)體免于發(fā)生自身免疫性系病,由此可見，CTLA-4基因多態(tài)性可決定CTLA-4的表達(dá)水平和調(diào)節(jié)功能。本研究將對(AT)n多態(tài)性與HSP的相關(guān)性進(jìn)行探討。

1材料與方法

1.1研究對象

選取2014年1月至2015年12月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的HSP患兒60例為病例組，HSP的診斷符合諸福棠《實(shí)用兒科學(xué)》[4]中的標(biāo)準(zhǔn)，均為陜西省漢族兒童，均為初發(fā)病例，入院前1個月未接受過糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療，排除了其他疾病如血液系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織病、原發(fā)腎病、乙肝病毒相關(guān)性腎炎及狼瘡性腎炎等繼發(fā)性腎臟損害，監(jiān)護(hù)人知情同意。病例組中男性33例，女性27例，平均年齡7.57±2.73歲。按有無腎臟損害分為有腎臟損害的過敏性紫癜(HSPN組)和無腎臟損害的過敏性紫癜(NHSPN組)；HSPN組30例，平均年齡7.77±2.36歲，NHSPN組30例，平均年齡7.37±3.08歲。

對照組來源于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診健康普查的陜西省漢族兒童，病史詢問排除既往過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，4周內(nèi)無感染及過敏史，經(jīng)體格檢查、肝腎功、尿常規(guī)等實(shí)驗(yàn)室檢查后確定為健康兒童，共30例，其中男性18例，女性12例，平均年齡7.57±2.54歲。

1.2研究方法

1.2.1血標(biāo)本的采集及DNA的提取

研究對象暫禁食12小時，次日清晨抽取空腹靜脈血2mL，置于含有EDTA抗凝液的試管中，于-80℃冰箱低溫保存。由北京天根生物公司合成的人類基因組全血DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2(AT)n基因多態(tài)性分析

①取1μL(AT)n PCR產(chǎn)物，加入24μL滅菌超純水振蕩混勻，將PCR產(chǎn)物稀釋25倍；②將9μL LIZ500稀釋液(0.2μL LIZ500+8.8μL Hi-Di)分裝到PCR孔板，然后加入1μL上述25倍稀釋的PCR產(chǎn)物，振蕩混勻后95°C變性5分鐘；③采用ABI3130xl測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件用Gene Mapper 4.0分析以判斷基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)出CTLA-4基因(AT)n等位基因頻率，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)比較以上等位基因頻率在各組間分布是否存在差異，以此判斷某等位基因與疾病的相關(guān)性，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基因分型膠電泳圖

將(AT)n PCR產(chǎn)物適當(dāng)處理后，采用ABI3130xl測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，得到每個樣本的分型膠電泳圖，單峰的為純合子，雙峰的為雜合子，見圖1、圖2。

圖1 純合子分型膠電泳圖

Fig.1 Homozygous type gel electropherogram

圖2 雜合子分型膠電泳圖

Fig.2 Heterozygous type gel electropherogram

2.2研究對象的遺傳吻合度檢驗(yàn)

因微衛(wèi)星變異較大，本研究納入病例組60例，對照組30例，所測出的基因型在病例組為30種，在對照組為17種，分別求得病例組與對照組各基因型的實(shí)際頻數(shù)與期望頻數(shù)后，經(jīng)比較人群(AT)n位點(diǎn)基因型實(shí)際頻數(shù)與期望頻數(shù)之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，樣本具有群體代表性，可用于群體遺傳學(xué)研究，見表1。

表1 遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)

Table 1 Inspection of genetic equilibrium alignment

STR 病例組 對照組 χ2Pχ2P(AT)n8．5801．0005．7230．991

2.3基因多態(tài)性分布情況

本研究CTLA-4(AT)n重復(fù)序列依AT重復(fù)次數(shù)不同可觀察到19種等位基因，AT重復(fù)次數(shù)從5次到34次不等。

2.3.1病例組與對照組各等位基因頻率的比較

當(dāng)AT重復(fù)次數(shù)為16時，等位基因頻率在病例組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，此等位基因?yàn)镠SP發(fā)病的危險因素，見表2。

表2 (AT)n等位基因頻率在病例組與對照組間的比較結(jié)果[n(%)]

注：a表示采用Fisher確切概率檢驗(yàn)。

2.3.2病例組中有無腎臟損害分層多態(tài)性分析

各等位基因頻率在HSPN組與NHSPN組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表3。

表3 (AT)n等位基因頻率在HSPN組和NHSPN組的比較結(jié)果[n(%)]

注：a表示采用Fisher確切概率檢驗(yàn)。

2.3.3病例組中性別分層多態(tài)性分析

當(dāng)AT重復(fù)次數(shù)為15時，等位基因頻率在男女組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，此等位基因?yàn)榕訦SP發(fā)病的危險因素，見表4。

表4 (AT)n等位基因頻率在男女兩組的比較結(jié)果[n(%)]

注：a表示采用Fisher確切概率檢驗(yàn)。

3討論

CTLA-4(AT)n序列是位于外顯子4末尾3′端的一串AT重復(fù)序列，屬于STRs，若AT在HSP中以異常高的頻率出現(xiàn)，則表明它與HSP發(fā)病具有相關(guān)性。(AT)n與重癥肌無力[5-6]、潰瘍性結(jié)腸炎及克羅恩病[7-8]的研究均提示它與這些自身免疫性疾病存在相關(guān)性，某些異常增高的AT重復(fù)次數(shù)為這些疾病發(fā)病的危險因素。對于此微衛(wèi)星位點(diǎn)與HSP的相關(guān)性，國內(nèi)外未見報道，本研究為首次對二者進(jìn)行相關(guān)性分析。

3.1(AT)n等位基因頻率在病例組和對照組的差異分析

本研究檢測到AT重復(fù)次數(shù)從5次到34次不等，每一個重復(fù)次數(shù)便代表一種等位基因，共檢出19種。通過比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AT重復(fù)次數(shù)為16時，等位基因頻率在病例組與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，此等位基因?yàn)镠SP發(fā)病的危險因素；可能系此重復(fù)序列影響CTLA-4的分子表達(dá)，使其對T細(xì)胞的抑制作用減弱，T細(xì)胞大量增殖活化，導(dǎo)致免疫分子分泌異常，增加了疾病的發(fā)病風(fēng)險。

3.2(AT)n等位基因頻率在有無腎臟損害的差異分析

將HSP組按照有無腎臟損害分層后比較，發(fā)現(xiàn)各等位基因頻率在HSPN組與NHSPN組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，證明各等位基因不能增加HSP患兒發(fā)生腎臟損害的風(fēng)險。

3.3(AT)n等位基因頻率在男女間的差異分析

將HSP按性別分層后分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AT重復(fù)次數(shù)為15時，等位基因頻率在男女兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，女性組等位基因頻率高于男性，說明此等位基因頻率可能是女性HSP患兒發(fā)病的危險因素；分析原因，可能系存在這些易感基因的患兒體內(nèi)CTLA-4表達(dá)水平下降，T細(xì)胞增殖及分化異常，造成免疫紊亂，增加了疾病的發(fā)生幾率。

綜上所述，CTLA-4作為維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的一個重要分子，其基因多態(tài)性與HSP有著密切的聯(lián)系，雖然其具體機(jī)制尚不能明確，但CTLA-4基因多態(tài)性對HSP的易感性、預(yù)后判斷和治療有著重要的意義。本次研究的樣本量較少，故還需加大樣本量去進(jìn)一步研究證實(shí)；也可以進(jìn)一步研究CTLA-4其他位點(diǎn)基因多態(tài)性與HSP的相關(guān)性，從基因水平對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：吳紅艷]

Association between CTLA-4 (AT)n gene polymorphism and Henoch-schonlein purpura

HOU Hong-hong1, HE Gai-tao2, LIU Li2, HUANG Yan-ping2

(1.Xi’anCentralHospital,ShaanxiXi’an710003,China;2.FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To investigate the association between cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4) (AT)n gene polymorphism and Henoch-schonlein purpura (HSP) in children. Methods Sixty children diagnosed as HSP in the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University from January 2014 to October 2015 were enrolled in case group. Thirty healthy children receiving health examination were enrolled in control group. Genotyping of 3’untranslated region of exon 4 was performed using capillary electrophoresis with ABI3130xl. Distribution of allele frequencies of microsatellite in different groups was analyzed. Results Totally 19 allele of microsatellite (AT)n were detected in both groups, among which AT repeated from 5 to 34 times. Significant difference was indicated in the comparison of allele frequencies between two groups when the repetition of AT was 16 (P=0.034,OR=2.115, 95%CI: 1.049-4.267). Microsatellite (AT)n was delaminated according to whether there was kidney damage, and there was no statistical significance in allele frequency between HSPN and NHSPN (P>0.05). Microsatellite (AT)n was delaminated according to gender, and there was statistical significance in allele frequency between male and female when AT repeated for 15 times (P=0.014,OR=0.210, 95%CI:0.055-0.805). Conclusion CTLA-4 (AT)n is associated with the susceptibility of HSP. Allele in which AT repeats 16 times may be the susceptible factor of HSP; and allele in which AT repeats 15 times may be the susceptible factor of HSP for female patients.

cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4); polymorphism; Henoch-schonlein purpura (HSP); children.

2016-10-19

侯紅紅(1989-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事兒童腎病的研究。

黃燕萍，主任醫(yī)師/教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.04.008

R725

A

1673-5293(2017)04-0385-04