人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)變化特征

賈利云 姚安會(huì) 李經(jīng)綸 劉 偉 王本瀚△

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000 2)解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450042 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450001

人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)變化特征

1,2)賈利云3)姚安會(huì)2)李經(jīng)綸2)劉 偉2)王本瀚2)△

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453000 2)解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450042 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450001

目的 探討人腦挫裂傷早期HMGB1表達(dá)的變化特征。方法 收集人腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)挫裂傷組織的標(biāo)本(正常組、6 h、12 h、24 h、72 h)，4%多聚甲醛固定，冰凍切片，然后進(jìn)行免疫熒光染色，統(tǒng)計(jì)分析各時(shí)間點(diǎn)HMGB1的表達(dá)情況；同時(shí)將HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN進(jìn)行共標(biāo)，觀察人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元損傷過(guò)程中從核內(nèi)向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況。結(jié)果 正常人腦組織的HMGB1表達(dá)主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，與正常組相比較，人腦挫裂傷組在傷后HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)于12 h開(kāi)始下降(P<0.05)，并持續(xù)至72 h；而HMGB1從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)的數(shù)目從6 h即開(kāi)始增加(P<0.05)，隨時(shí)間增加HMGB1也隨之大量轉(zhuǎn)移到胞漿中，在人腦挫裂傷后24 h 達(dá)到高峰(P<0.05)。人腦挫裂傷后早期，HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元中(P>0.05)，腦挫裂傷后神經(jīng)元的數(shù)目逐漸減少(P<0.05)，而HMGB1從神經(jīng)元核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例在6 h明顯增加(P<0.05)，于24～72 h達(dá)到高峰(P<0.05)。結(jié)論 人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元死亡或凋亡數(shù)目明顯增加，HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也在損傷后減少；而HMGB1神經(jīng)元從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例升高；HMGB1可能參與了腦挫裂傷后神經(jīng)元的死亡或凋亡。

顱腦損傷；HMGB1；神經(jīng)元

隨著現(xiàn)代化的進(jìn)程，交通及建筑業(yè)的發(fā)展，顱腦損傷的發(fā)生率越來(lái)越高，創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是世界各地衛(wèi)生保健系統(tǒng)亟待解決的重大難題，已成為威脅人們健康的主要原因之一[1-2]。高遷移率組蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)為19世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一種在細(xì)胞核內(nèi)廣泛存在、序列高度保守的非組蛋白[3]。HMGB1最初只作為一種核內(nèi)蛋白研究其在細(xì)胞核內(nèi)的功能，包括參與核小體的構(gòu)建與功能、DNA的重組修復(fù)和復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等[4]。Wang等[5]首先發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞受到內(nèi)毒素等刺激后可以釋放HMGB1到細(xì)胞外，并作為一種炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。釋放到胞外的HMGB1不僅可以參與各種炎癥性疾病，而且在腫瘤、病毒性疾病、創(chuàng)傷、再灌注損傷等的病理過(guò)程中也起著重要作用。HMGB1可以由壞死細(xì)胞的被動(dòng)釋放或炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)的主動(dòng)釋放[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TBI 后HMGB1 由壞死和損傷的神經(jīng)細(xì)胞釋放。釋放的HMGB1與細(xì)胞膜表面受體，如RAGE、Toll樣受體等模式識(shí)別受體結(jié)合，進(jìn)而激活免疫細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，一方面介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；另一方面，通過(guò)多種復(fù)雜的病理生理機(jī)制，對(duì)腦組織造成二次損傷，形成惡性循環(huán)[7-8]。以往關(guān)于HMGB1在腦挫裂傷后的研究多基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而且多集中在腦挫裂傷后炎癥反應(yīng)的形成機(jī)制方面。對(duì)人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá)變化，尤其是損傷后早期神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)特點(diǎn)的研究甚少。為此，我們通過(guò)收集人腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)手術(shù)標(biāo)本，分析人腦挫裂傷早期HMGB1的表達(dá)情況。

1 資料和方法

1．1 一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)顱腦CT 證實(shí)為腦挫裂傷，年齡30～60 歲且需手術(shù)治療的患者40 例。排除年齡較大或較小、存在其他器官?gòu)?fù)合傷患者8 例，32例患者納入實(shí)驗(yàn)樣本，其中男25例，女7例，年齡30～40 歲，平均31.34歲，標(biāo)本均為挫裂傷腦組織中心約3 cm 范圍內(nèi)的腦組織；正常腦組織5例(腦腫瘤手術(shù)暴露過(guò)程中行額極或顳極切除的腦組織)，腦挫裂傷6 h組6例，腦挫裂傷12 h組8例，腦挫裂傷24 h組8例，腦挫裂傷72 h組5例。實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍153醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)證通過(guò)，且均征得患者家屬同意，并簽署知情同意書(shū)。

1．2 組織制備 將標(biāo)本取出后，用4%多聚甲醛(pH=7.4，4 ℃)固定。然后置于含25%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中，4 ℃保存，直至標(biāo)本沉底。用恒冷箱切片機(jī)(Leica，CM1900)行連續(xù)矢狀切片，片厚16 μm，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 主要試劑與儀器 一抗：兔抗人HMGB1單克隆抗體(Abcam，美國(guó))；小鼠抗人NeuN單克隆抗體(Millipore，美國(guó))；小鼠抗人GFAP單克隆抗體(Millipore，美國(guó))；山羊抗人Iba-1單克隆抗體(Abcam，美國(guó))；二抗：山羊抗兔FITC(中杉金橋，中國(guó))；山羊抗鼠TRITC(中杉金橋，中國(guó))；驢抗山羊CY3(Beyotime，中國(guó))；驢抗兔Alexa Fluor 488(Molecular Probes，美國(guó))；DAPI(Solarbio，中國(guó))；熒光顯微鏡：Olympus BX51。

1．4 免疫熒光染色 HMGB1與DAPI共標(biāo)：取一套切片入無(wú)triton含1%胎牛血清的封閉液室溫封閉30 min，然后用0.01%的PBS(pH 7.4)浸洗3次，每次5 min。加入兔抗人HMGB1(1：200，Abcam)孵育，室溫過(guò)夜(16～24 h)，0.01%的PBS清洗3次，每次5 min，然后加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1：200)的二抗及DAPI(1：1 000)。37 ℃室溫避光2 h。之后用0.01%的PBS清洗后以50%甘油溶液封片；顯微鏡觀察并照片。HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP或小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1進(jìn)行雙標(biāo)：取一套切片分A、B、C3組，入無(wú)triton含1%胎牛血清的封閉液室溫封閉30 min，然后用0.01%的PBS(pH 7.4)浸洗3次，5 min/次。A組加入兔抗人HMGB1(1：200，Abcam)和小鼠抗人NeuN(1：50，Millipore)孵育；B組加入兔抗人HMGB1(1：200，Abcam)和小鼠抗人GFAP(1：200，Millipore)孵育；C組加入兔抗人HMGB1(1：200，Abcam)和山羊抗人Iba-1(1：200，Abcam)孵育。室溫過(guò)夜(16～24 h)，0.01%的PBS清洗3次，5 min/次，然后A組加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1：200)及含有TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1：200)的二抗及DAPI(1： 1 000)；B組加入相應(yīng)含有FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1：200)及含有TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (1：200)的二抗及DAPI(1：1 000)；C組加入相應(yīng)含有Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgG(1：200)及含有CY3標(biāo)記的驢抗山羊IgG(1：200)的二抗及DAPI(1：1 000)。37 ℃室溫避光2 h。用0.01%的PBS清洗后以50%甘油溶液封片，并用熒光顯微鏡BX-51觀察，隨即選取4個(gè)視野進(jìn)行照相。

1．5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 表達(dá)HMGB1的細(xì)胞：HMGB1與細(xì)胞標(biāo)記物NeuN、GFAP或Iba-1及細(xì)胞核標(biāo)記物DAPI三者共標(biāo)的細(xì)胞；從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：HMGB1同時(shí)存在于核內(nèi)及胞漿內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。選擇每張切片免疫反應(yīng)較強(qiáng)的區(qū)域，視野(×200)下觀察4個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)HMGB1染色細(xì)胞。計(jì)算表達(dá)在胞核中的HMGB1的細(xì)胞數(shù)、胞漿中的HMGB1細(xì)胞數(shù)、胞核胞漿共同表達(dá)HMGB1的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2．1 人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá) 通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)腦挫裂傷組織進(jìn)行HMGB1與DAPI共標(biāo)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，HMGB1陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)于人腦挫裂傷后12 h開(kāi)始下降(P<0.05)，并持續(xù)下降至72 h(P<0.05)；而HMGB1從細(xì)胞核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)移的比例在人腦挫裂傷后6 h 明顯增加(P<0.05)，并逐漸升高，于人腦挫裂傷后24 h達(dá)到高峰(P<0.05)，于72 h表達(dá)有所下降(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2．2 人腦挫裂傷后早期HMGB1的表達(dá)主要在神經(jīng)元 于各時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行HMGB1與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP或小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1免疫熒光染色；對(duì)表達(dá)HMGB1的神經(jīng)元數(shù)目與總HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人腦挫裂傷早期HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元，各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 人腦挫裂傷后HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)比例(免疫熒光染色，×200) 1A、1B、1C：正常組；2A、2B、2C：腦挫裂傷6 h；3A、3B、3C：腦挫裂傷12 h；4A、4B、4C：腦挫裂傷24 h；5A、5B、5C：腦挫裂傷72 h(A、B、C分別為DAPI、HMGB1、Merge；注：HMGB1染為綠色，DAPI染為藍(lán)色)；6A：HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖，與正常組比較，*P<0.05；6B：HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖，與正常組比較，*P<0.05，與前一組比較，#P<0.05

圖2 人腦挫裂傷后HMGB1表達(dá)的細(xì)胞分布(免疫熒光染色，×200) A為人腦挫裂傷后24 h NeuN與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色，NeuN染為紅色)；B為人腦挫裂傷后24 h GFAP與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色，GFAP染為紅色)；C為人腦挫裂傷后24 h Iba-1與HMGB1共標(biāo)(HMGB1染為綠色，Iba-1染為紅色)；D人腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元表達(dá)HMGB1的比例

2．3 HMGB1在神經(jīng)元表達(dá)的特點(diǎn) 將人腦挫裂傷后早期不同時(shí)間點(diǎn)的組織切片進(jìn)行HMGB1、NeuN及DAPI的免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人腦挫裂傷后神經(jīng)元的數(shù)目逐漸減少(P<0.05)；而HMGB1從神經(jīng)元核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)移的比例在傷后6 h明顯增加(P<0.05)，并逐漸升高，于人腦挫裂傷后24～72 h達(dá)到高峰(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 人腦挫裂傷后不同時(shí)間點(diǎn)HMGB1神經(jīng)元表達(dá)情況(免疫熒光染色，×200) 1A、1B、1C：正常組；2A、2B、2C：腦挫裂傷后6 h；3A、3B、3C：腦挫裂傷12 h；4A、4B、4C：腦挫裂傷24 h；5A、5B、5C：腦挫裂傷72 h(A為HMGB1與DAPI共標(biāo)，B為NeuN與DAPI共標(biāo)，C為三者M(jìn)erge共標(biāo)；注：HMGB1染為綠色；NeuN染為紅色；DAPI染為藍(lán)色)；箭頭所示：HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿外，神經(jīng)元與其共標(biāo)。6A：神經(jīng)元HMGB1陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)圖，與正常組比較，*P<0.05；6B：神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞中HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿比例統(tǒng)計(jì)圖，與正常組比較，*P<0.05，與前一組比較，#P<0.05

3 討論

HMGB1是一個(gè)普遍存在且高度保守的蛋白，在細(xì)胞內(nèi)，HMGB1能與DNA結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)架構(gòu)發(fā)揮調(diào)控翻譯，修復(fù)和重組的作用[9-10]。最近研究表明、HMGB1可以被氧化而發(fā)揮多種作用，包括亞細(xì)胞定位、調(diào)控DNA、細(xì)胞因子、調(diào)控免疫等多種作用[4]。雖然HMGB1主要存在細(xì)胞內(nèi)，但在細(xì)胞受到刺激、細(xì)胞死亡、凋亡，組織缺氧及缺血/再灌注時(shí)，HMGB1可以被釋放到胞漿及細(xì)胞外[9]。早期大量研究表明，TBI可引起細(xì)胞壞死、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種病理生理變化[11]。Wang等通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1參與了蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡。鄧必高等[12]研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可以影響大鼠內(nèi)毒素腦損傷后的HMGB1表達(dá)。黃海英等[13]研究表明，通過(guò)臍帶血檢測(cè)HMGB1可以對(duì)在妊娠高血壓產(chǎn)婦的新生兒腦損傷程度進(jìn)行判斷。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在人腦挫裂傷后早期從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿的比例逐漸增高，于傷后24 h達(dá)到高峰。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在小鼠腦挫裂傷后6 h表達(dá)明顯下降，而在2 d后其表達(dá)恢復(fù)至正常水平。而我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)，HMGB1在人腦挫裂傷后6 h表達(dá)開(kāi)始下降，然而其下降一直維持至72 h。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，人腦挫裂傷后早期HMGB1主要表達(dá)在神經(jīng)元，且隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元的數(shù)目在明顯下降，而HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至胞漿的比例卻明顯增高。HMGB1作為致炎因子在顱腦損傷后的病理變化中起重要作用，顱腦損傷后，細(xì)胞水腫、缺氧、炎癥反應(yīng)、壞死、凋亡等多種病理變化均可促使HMGB1的轉(zhuǎn)移及釋放，而釋放的HMGB1又可以參與到顱腦損傷的繼發(fā)性損傷中[14-15]。我們推測(cè)HMGB1參與了人腦挫裂傷后早期神經(jīng)元的凋亡或死亡，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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(收稿2016-12-27)

The features of HMGB1 expression in early traumatic brain injury

LiuLeizhen*，JiaLiyun，YaoAnhui，LiJinglun，LiuWei，WangBenhan

*XinxiangMedicalCollege，Xinxiang453000，China

Objective To explore the features of high-mobility group box 1(HMGB1)expression in early traumatic brain injury(TBI)．Methods We collected traumatic brain tissues induced by traumatic brain injury at different time point(6 h，6 h，12 h，24 h and 72 h)and normal brain tissues which were fixed by 4% paraformaldehyde．After performing frozen section and using immunofluorescent staining，we statistically analyzed the expression of HMGB1．At the same time，we observed the transferring situation from cell nucleus to cytoplasm in the process of early traumatic brain injury by marking HMGB1 and neuronal specific marker(NeuN)．Results HMGB1 expression of normal brain tissues was concentrated in nucleus．The number of HMGB1 positive cells in traumatic brain tissues was decreased at 12 h(P<0.05)，which lasted to 72 h．The number of HMGB1 transferring from cell nucleus to cytoplasm was increased at 6 h(P<0.05)and reach the peak at 24 h after traumatic brain injury(P<0.05)，which showed that with the prolonged time，the more number of HMGB1 transferred to cytoplasm．In early traumatic brain injury，HMGB1 mainly expressed in neurons(P>0.05)which were decreased gradually(P<0.05)．We also found the number of HMGB1 transferring from nucleus to cytoplasm was significantly increased at 6 h(P<0.05)，and peaked at 24～72 h(P<0.05)．Conclusion The number of neurons’ death or apoptosis was decreased after TBI in human，and number of HMGB1 positive cells was also decreased．The ratio of HMGB1 transferring from nucleus into cytoplasm was significantly increased．HMGB1 may participate in the neurons’ death or apoptosis．

Traumatic brain injury；High mobility group box 1；Neuron

全軍青年基金項(xiàng)目(14QNP029)

R-332

A

1673-5110(2017)09-0017-05

△通訊作者：王本瀚，E-mail：wangbenhan@sina.com