核蛋白Sam68的原核表達及鑒定

張華，陳寧，丁筠，鄒德華，潘子夜，李鵬飛，李麗陽，肖麗杰，曹宏偉

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科）

核蛋白Sam68的原核表達及鑒定

張華1，陳寧1，丁筠1，鄒德華1，潘子夜1，李鵬飛2，李麗陽1，肖麗杰1，曹宏偉1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科）

為了構(gòu)建pGEX-4T-1-Sam68原核表達載體，表達并鑒定GST-Sam68融合蛋白，采用PCR擴增Sam68基因，插入pGEX-4T-1的EcoR I和Sal I位點，并轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）大腸桿菌，IPTG誘導表達，SDS-PAGE和Western Blot驗證蛋白表達，GST pull-down技術(shù)驗證Sam68的結(jié)合活性。酶切和測序結(jié)果證實Sam68基因正確插入pGEX-4T-1載體中，載體能夠在Rosetta（DE3）細胞中正確表達，且純化的GST-Sam68蛋白具有與PI3K p85特異結(jié)合的活性，說明成功構(gòu)建了原核表達載體pGEX-4T-1-Sam68。

Sam68；原核表達；載體構(gòu)建；鑒定

Sam68（Src associated in mitosis 68 kDa，Sam68）屬于RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）信號轉(zhuǎn)導與RNA活化蛋白家族（signal transduction and activation of RNA，STAR）成員，是酪氨酸激酶Src的靶蛋白，在細胞增殖和分化過程中發(fā)揮著重要的作用，可調(diào)控細胞周期進程及細胞凋亡[1]。Sam68表達廣泛，在信號轉(zhuǎn)導，基因轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接中起著重要的作用，與細胞內(nèi)的許多信號分子，包括Src、Grb2、Grap、SHP-1、PLCγ1/Fyn、BRK和PI3K等存在相互作用，參與T細胞受體、胰島素受體信號轉(zhuǎn)導及Ras和PI3K激酶途徑[2-3]。實驗觀察表明，Sam68與多種腫瘤發(fā)生、信號轉(zhuǎn)導途徑相關，特別是在內(nèi)分泌有關的癌癥中Sam68發(fā)揮著關鍵作用[4]。同時，近期研究也發(fā)現(xiàn)Sam68在脂肪細胞和神經(jīng)元的發(fā)育過程中也扮演著重要的角色，與骨質(zhì)疏松、肥胖、不孕不育、性共濟失調(diào)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病也存在著一定的關系[5-7]。為了進一步了解Sam68在腫瘤細胞增殖、凋亡中的作用及其信號轉(zhuǎn)導中的功能，我們構(gòu)建了Sam68的原核表達載體，并在Rosetta細胞中進行了表達、純化、Western驗證及結(jié)合活性檢測，為后續(xù)研究Sam68在腫瘤細胞增殖、凋亡中的作用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑

鼠單克隆抗GST抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠和羊抗兔抗體購自北京中衫金橋生物技術(shù)公司；兔單克隆抗Sam68抗體購自Epitomics公司；兔抗PI3K p85抗體購自CST公司；GST beads購自Abmart公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購于Omega公司；PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Solution I連接酶購自TaKaRa公司；高保真pfu聚合酶購自NEB公司；引物合成和序列測定由Invitrogen公司完成；感受態(tài)細胞DH5α、Rosseta（DE3）購自博邁德公司；pEGFP-Sam68與pGEX-4T-1載體由實驗室保存。

1.2 引物設計

根據(jù)NCBI GenBank（Accession No.：NM_006559）所提供的Sam68基因序列設計引物，正向引物：5'CGGAATTCATGCAGCGCCGGGACGACCCCGCCG3’（EcoRI），反向引物：5'GCGTCGACCTAATAACGTCCA TATGGGTGC3’（Sal I），擬將Sam68基因片段插入pGEX-4T-1的EcoR I/Sal I位點。

1.3 Sam68基因的PCR擴增

以pEGFP-Sam68為模板，擴增Sam68基因，PCR體系：10×pfu緩沖液5 μL，2.5 mM dNTP混合液4 μL，20 mM 10×Mg2SO42.5 μL，模板cDNA＜500 ng，正向引物0.5 μM，反向引物0.5 μM，5 U·μL-1NEB pfu酶0.25 μL，反應體系50 μL。PCR反應條件為：98℃預變性2 min，98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個反應循環(huán)，72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶回收，PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測序，正確的片段-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 pGEX-4T-1-Sam68的構(gòu)建及鑒定

將PCR獲得的Sam68片段與pGEX-4T-1載體，分別37℃EcoR I/Sal I雙酶切過夜，膠回收，然后按照載體與片段摩爾比1∶6的比例，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h，挑菌接種試管培養(yǎng)12～16 h，菌液PCR鑒定為陽性克隆后，抽提質(zhì)粒，送Invitrogen公司測序，將正確重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-Sam68，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蛋白表達與純化

將pGEX-4T-1-Sam68質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosseta（DE3），方法同1.2.3。挑取陽性克隆接種至20 mL LB培養(yǎng)基37℃活化12～16 h，然后將20 mL菌液接種至2 000 mL LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2～3 h至菌液吸光度OD 0.6～0.8，加入0.1 mM IPTG，16℃低溫誘導16～24 h，SDS驗證蛋白的表達。誘導的菌液4 000 rpm 10 min，用50 mL緩沖液（100 mM Tis-Hcl，50 mM NaCl）重懸菌體，超聲破碎菌體，12 000 rpm 30 min,收集上清，0.22 μm濾膜過濾，4℃?zhèn)溆?。GST珠子先用高pH緩沖液（0.1 M Tris，0.5 M NaCl，pH8.0）和低pH值緩沖液洗滌（0.1 M NaAc，0.5 M NaCl pH4.5）各3個柱體積，重復3次，然后用緩沖液平衡5個柱體積，1 mL·min-1上樣，用10個柱體積緩沖液洗去雜蛋白，最后用，5個柱體積的Elution Buffer（20 mM還原型谷胱甘肽）洗脫目的蛋白。收集純化的GST-Sam68蛋白，用50 KD的超濾杯進行濃縮，SDS-PAGE檢測濃縮效果。

1.6 Western Blot檢測

目的蛋白加入SDS loading buffer后，煮沸10 min，12 000 g 10 min，12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶封閉2 h，用小鼠抗GST單克隆抗體室溫孵育1 h，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，曝光，拍照。

1.7 GST pull-down實驗

500 μL PBS洗GST Beads 2次，加入GSTSam68蛋白，4℃孵育2小時，4℃離心，PBS洗2次，棄上清。加入細胞裂解上清，4℃孵育2小時，PBS洗2次。吸走剩余PBS，留20 μL左右，加入5×上樣Buffer，沸水煮10 min，12 000 g離心10 min，SDSPAGE，Western Blot檢測Sam68與PI3K 85亞基的相互作用。SDS-PAGE，Western Blot方法同上，其中，Western Blot選用的是兔抗PI3K p85抗體。

2 結(jié)果

2.1 Sam68的PCR擴增結(jié)果

pEGFP-Sam68質(zhì)粒帶有Sam68基因，我們以pEGFP-Sam68質(zhì)粒為模板，設計特異性引物，PCR擴增Sam68基因，圖1顯示PCR所擴增的片段大小約為1 332 bp，與預計大小相符，為特異的Sam68片段。

圖1 Sam68 PCR擴增結(jié)果Fig.1The resultant PCR amplification of Sam68

2.2 pGEX-4T-1-Sam68的酶切鑒定及序列測定

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Sam68，經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳，圖2顯示酶切片段Sam68約為1 332 bp，與預計大小相符。對重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Sam68目的基因片段進行DNA序列測定，結(jié)果顯示，DNA序列及閱讀框完全正確，這些結(jié)果說明我們成功構(gòu)建了真核表達載體pGEX-4T-1-Sam68。

圖2 pGEX-4T-1-Sam68限制性酶切分析Fig.2Restriction endonuclease analysis of pGEX-4T-1-Sam68

2.3 SDS-PAGE檢測GST-Sam68蛋白的表達與純化

轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1-Sam68質(zhì)粒的重組菌在不同時間點誘導表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量約95 kDa處可見明顯條帶，而空載體重組菌的誘導表達產(chǎn)物則無此條帶。圖3顯示，此重組菌中GSTSam68能特異性地表達，表達大小與預期的相符。該蛋白經(jīng)過GST珠子四輪純化，獲得了GST-Sam68的純化蛋白。收集純化的GST-Sam68蛋白，用50 kDa的超濾杯進行濃縮，SDS-PAGE進行檢測（line 8）。

圖3 GST-Sam68蛋白的表達與純化Fig.3Expression and purification of GST-Sam68 protein

2.4 Western blot檢測GST-Sam68蛋白的表達

表達純化的目的蛋白，用鼠抗GST單克隆抗體檢測GST-Sam68重組融合蛋白。圖4結(jié)果顯示，表達的GST-Sam68重組融合蛋白，特異性結(jié)合鼠抗GST單克隆抗體，蛋白大小約為95 kDa，蛋白與預計大小相符，說明我們構(gòu)建的原核表達載體能夠正確表達出融合蛋白GST-Sam68。

圖4 Western Blot鑒定GST-Sam68融合蛋白Fig.4Western Blot analysis of GST-Sam68 fusion protein

2.5 Sam68與PI3K的結(jié)合活性

Sam68是一種接頭蛋白，與細胞內(nèi)諸多蛋白存在相互作用，為了驗證所表達的GST-Sam68的結(jié)合活性，我們選取GST pull-down來研究Sam68對PI3K p85的結(jié)合活性。圖5結(jié)果顯示，GST-Sam68能夠?qū)I3K p85 pull-down下來，而對照卻不能將PI3K p85 pull-down下來，說明GST-Sam68融合蛋白具有與PI3K p85特異性結(jié)合的活性，結(jié)果說明我們純化的GST-Sam68是具有蛋白結(jié)合活性的。

圖5 GST pull-down分析GST-Sam68Fig.5GST pull-down analysis of GST-Sam68

3 討論

Sam68不僅在調(diào)控RNA的代謝過程中發(fā)揮著重要作用，同時Sam68還調(diào)控著CD44、Bcl-xl、Sgce、Cyclin D1和mTOR等基因的RNA選擇性剪接[8-11]。Sam68作為一個接頭蛋白，通過其富含脯氨酸的基序及SH2、SH3和WW結(jié)構(gòu)域與許多信號轉(zhuǎn)導蛋白相互作用，如Src、BRK、PI3K、FBP21和FBP30[12-15]。此外，Sam68還是TNF-α誘導NF-κB的活化和細胞凋亡的必須因子[16]。多項研究表明，在多種人類癌癥中Sam68的表達上調(diào)，包括前列腺癌，腎細胞癌和乳腺癌，Sam68可能作為一個致癌基因，促進腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移[17-18]。Sam68的表達和細胞質(zhì)定位與早期宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后相關[19]，是腎細胞癌的一個重要和獨立的預后標志物[20]，Sam68高水平表達和核定位常預示著結(jié)腸癌的發(fā)展和預后不良[2]。鑒于Sam68在信號轉(zhuǎn)導方面的重要功能，為了進一步研究Sam68在調(diào)控細胞生長中的作用，研究構(gòu)建了Sam68與GST蛋白的融合原核表達載體，并表達純化了GSTSam68蛋白。誘導表達后的結(jié)果顯示：Sam68在Rosseta感受態(tài)中能夠正確表達，證明構(gòu)建和誘導表達都是成功的。在高效表達GST-Sam68融合蛋白后，采用文獻報的GST珠子，對蛋白進行了純化[21]，而且獲得了純化的蛋白，并對獲得的純化蛋白進行了鑒定，GST pull-down實驗也證實了融合蛋白GST-Sam68具有特異性結(jié)合PI3K p85的活性，證實Sam68在信號轉(zhuǎn)導中的作用。研究獲得的純化蛋白，為我們進一步研究Sam68在信號轉(zhuǎn)導中的作用奠定了一定的基礎。

［1］Sette C，Messina V，Paronetto M P.Sam68：a new STAR in the male fertility firmament［J］.J Androl，2010，31（1）：66-74.

［2］Liao W T，Liu J L，Wang Z G，et al.High expression level and nuclear localization of Sam68 are associated with progression and poor prognosis in colorectal cancer［J］.BMC Gastroenterol，2013，13（1）：126-134.

［3］Quintana-Portillo R，Canfran-Duque A，Issad T，et al.Sam68 interacts with IRS1［J］.Biochem Pharmacol，2012，83（1）：78-87.

［4］Bielli P，Busa R，Paronetto M P，et al.The RNA-binding protein Sam68 is a multifunctional player in human cancer ［J］.Endocr Relat Cancer，2011，18（4）：91-102.

［5］Vogel G，Richard S.Emerging roles for Sam68 in adipogenesis and neuronal development［J］.RNA Biol，2012（9）：1129-1133.

［6］Klein M E，Younts T J，Castillo P E，et al.RNA-binding protein Sam68 controls synapse number and local betaactin mRNA metabolism in dendrites［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（8）：3125-3130.

［7］張皓，田金華，樸明淑，等.氣腫疽梭菌鞭毛基因克隆載體的構(gòu)建［J］.延邊大學農(nóng)學學報，2015（2）：91-95.

［8］Paronetto M P，Achsel T，Massiello A，et al.The RNA-binding protein Sam68 modulates the alternative splicing of Bcl-x［J］.J Cell Biol，2007，176（7）：929-939.

［9］Chawla G，Lin C H，Han A，et al.Sam68 regulates a set of alternatively spliced exons during neurogenesis［J］.Mol Cell Biol，2009，29（1）：201-213.

［10］Paronetto M P，Cappellari M，Busa R，et al.Alternative splicing of the cyclin D1 proto-oncogene is regulated by the RNA-bindingprotein Sam68［J］.Cancer Res，2010，70（1）：229-239.

［11］Huot M E，Vogel G，Zabarauskas A，et al.The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis［J］.Mol Cell，2012，46（2）：187-199.

［12］Martin-Romero C，Sanchez-Margalet V.Human leptin activates PI3K and MAPK pathways in human peripheral blood mononuclear cells：possible role of Sam68［J］.Cell Immunol，2001，212（2）：83-91.

［13］Taylor S J，Shalloway D.An RNA-binding protein associated with Src through its SH2 and SH3 domains in mitosis［J］.Nature，1994，368（6474）：867-871.

［14］Najib S，Martin-Romero C，Gonzalez-Yanes C，et al.Role of Sam68 as an adaptor protein in signal transduction［J］. Cell Mol Life Sci，2005，62（1）：36-43.

［15］Asbach B，Ludwig C，Saksela K，et al.Comprehensive analysis of interactions between the Src-associated protein in mitosis of 68 kDa and the human Src-homology 3 proteome［J］.PLoS One，2012（6）：38540.

［16］Ramakrishnan P，Baltimore D.Sam68 is required for both NF-kappaB activation and apoptosis signaling by the TNF receptor［J］.Mol Cell，2011，43（2）：167-179.

［17］Elliott D J，Rajan P.The role of the RNA-binding protein Sam68 in mammary tumourigenesis［J］.J Pathol，2010，222（3）：223-226.

［18］孫婷婷，金京順，賈立軍，等.新孢子蟲與弓形蟲交叉抗原基因AMA 1的克隆及原核表達載體構(gòu)建［J］.延邊大學農(nóng)學學報，2015（1）：8-11.

［19］Li Z，Yu C P，Zhong Y，et al.Sam68 expression and cytoplasmic localization is correlated with lymph node metastasis as well as prognosis in patients with early-stage cervical cancer［J］.Ann Oncol，2012，23（3）：638-646.

［20］Zhang Z，Li J，Zheng H，et al.Expression and cytoplasmic localization of SAM68 is a significant and independent prognostic marker for renal cell carcinoma［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18（10）：2685-2693.

［21］孫強，楊麗麗.Mtx1和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究進展［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2014，26（3）：10-13.

Prokaryotic Expression and Identification of Nuclear Protein Sam68

Zhang Hua1，Chen Ning1，Ding Yun1，Zou Dehua1，Pan Ziye1，Li Pengfei2，Li Liyang1，Xiao Lijie1，Cao Hongwei1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Departement of Nephrology，The Fifth Affiliated Hospital of Harbin Medical University）

In order to prokaryotically express and identify the nuclear protein Sam68，Sam68 gene fragment was firstly amplified by PCR.The PCR product was cloned into EcoR I and Sal I site of pGEX-4T-1.The recombinant vector pGEX-4T-1-Sam68 was transformed into Rosetta（DE3），and competent cells were induced by IPTG to express the fusion protein.GST beads were used for purifying the GST-Sam68 fusion protein.SDS-PAGE and Western blot were used for identification of the fusion expression.GST pulldown was performed for detection of binding activity of GST-Sam68.Restriction endonuclease digestion and sequence analysis confirmed that Sam68 was inserted into pGEX-4T-1，and the vector expressed the GST-Sam68 fusion protein correctly.The purified GST-Sam68 fusion protein could bind to PI3K p85，suggesting that prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-Sam68 had been constructed successfully.

Sam68；prokaryotic expression；construction of vector；identification

Q78

A

1002-2090（2017）03-0073-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.016

2016-04-06

國家自然科學基金（31300145、31570159）；黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究面上項目（12541578）;中國博士后科學基金面上項目（2016M590297）;黑龍江省政府博士后資助經(jīng)費（LBH-Z15188）；黑龍江八一農(nóng)墾大學博士科研啟動基金（XDB2015-16）。

張華（1979-），男，副教授，中國科學院畢業(yè)，現(xiàn)主要從事分子免疫學、分子病毒學方向的研究工作。

曹宏偉，女，教授，碩士研究生導師，E-mail：hettieluck@hotmail.com。