阮立奇，黃波

（解放軍第117醫(yī)院 骨二科，浙江 杭州 310013）

·論 著·

Wnt/β-catenin信號通路在去睪丸小鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用

阮立奇，黃波

（解放軍第117醫(yī)院 骨二科，浙江 杭州 310013）

目的：研究Wnt/β-catenin信號通路在去睪丸小鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用。方法：11月齡雄性健康ICR小鼠30只，隨機(jī)分為3組，睪丸切除組、睪丸切除+雄激素替代組和假手術(shù)組，每組10只。睪丸切除組和睪丸切除+雄激素替代組摘除小鼠雙側(cè)睪丸，假手術(shù)組僅切開皮膚，分離睪丸包膜。手術(shù)后睪丸切除+雄激素替代組丙酸睪酮肌注每次10 μg，每隔3 d注射1次；睪丸切除組和假手術(shù)組0.9%氯化鈉溶液肌注每次10 μg，每隔3 d注射1次。飼養(yǎng)14周后，檢測3組小鼠骨密度（BMD）。處死后心臟采血，ELISA法檢測雌、雄激素含量。取小鼠骨組織，部分提取RNA并翻轉(zhuǎn)成為cDNA，再通過實(shí)時熒光定量PCR法檢測β-catenin和Runx2的mRNA表達(dá)；部分提取總蛋白，通過Western blot法檢測β-catenin和Runx2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比，睪丸切除+雄激素替代組和睪丸切除組BMD值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；睪丸切除+雄激素替代組與睪丸切除組比較BMD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比，睪丸切除組小鼠β-catenin和Runx2的mRNA和蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；使用雄激素替代治療后，β-catenin和Runx2的mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：去睪丸骨質(zhì)疏松小鼠Wnt/β-catenin信號通路受到抑制，可能是其骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展的重要分子生物學(xué)機(jī)制之一。

睪丸切除；小鼠；骨質(zhì)疏松；Wnt/β-catenin信號通路

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典Wnt信號通路，即Wnt/β-catenin信號通路對骨重建的影響主要表現(xiàn)在對成骨細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生影響[1]，同時影響成骨細(xì)胞的功能和活性[2]。β-catenin為Wnt/β-catenin信號通路上的關(guān)鍵因子，Wnt/β-catenin通路上大量相關(guān)因子都是需要通過影響β-catenin的表達(dá)改變來影響下游靶基因的表達(dá)[3]。Runx2的表達(dá)是成骨細(xì)胞開始分化的標(biāo)志，是Wnt/β-catenin信號通路下游上的相關(guān)因子，Wnt/β-catenin信號通路激活與否直接影響著Runx2的活性及表達(dá)[4]。當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)后，Runx2的表達(dá)隨之下調(diào)，兩者有較為密切的聯(lián)系[5]。所以，Wnt/β-catenin信號通路的變化可能是雄性原發(fā)骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要分子生物學(xué)機(jī)制之一。本研究通過檢測去睪丸小鼠骨的Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵因子mRNA及蛋白的表達(dá)變化，揭示雄性原發(fā)骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為從該機(jī)制阻斷致病因素提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康ICR小鼠30只，體質(zhì)量37～44 g，雄性，11月齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器：小鼠雄激素、雌激素ELISA試劑盒，Trizol Reagent，1st-Strand cDNA Synthesis Kit，40%丙烯酰胺溶液，總蛋白提取試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒（含Protease Inhibitor Cocktail）（杭州浩基生物科技有限公司），RNase-Free DNase I（德國Qiagen公司），Power SYBR? Master Mix（美國Invitrogen公司）；anti-Runx2 antibody、anti-β-catenin antibody、內(nèi)參β-actin（美國Santa Cruz公司）；羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP、SuperSignal?West Dura Extended Duration Substrate（美國Pierce公司）；雙能X線骨密度儀（美國GE公司），酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模：30只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、睪丸切除組和睪丸切除+雄激素替代組，每組10只。于清潔動物室單籠常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后3組小鼠均采用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后仰臥位固定，5%碘伏消毒陰囊及附近皮膚。睪丸切除組及睪丸切除+雄激素替代組小鼠沿正中縱行切開陰囊，分離睪丸包膜，結(jié)扎輸精管及睪丸動脈后切除雙側(cè)睪丸，取少量青霉素G放入腹腔后縫合皮膚。假手術(shù)組僅切開皮膚，分離睪丸包膜，取少量青霉素G放入腹腔后縫合皮膚。睪丸切除+雄激素替代組肌肉注射丙酸睪酮每次10 μg，每3 d注射1次，假手術(shù)組和睪丸切除組肌肉注射0.9%氯化鈉溶液每次10 μg，每3 d注射1次。

1.2.2 骨密度（bone mineral density，BMD）及雌、雄性激素含量測定：小鼠手術(shù)后放入原籠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)14周。14周后均采用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后俯臥位固定，腰椎盡可能保持筆直，雙側(cè)股骨保持伸展，使用X線骨密度儀測定雙側(cè)股骨的BMD。然后立即心臟采血，ELISA法測定雌二醇及睪酮水平。

1.2.3 RT-PCR技術(shù)檢測小鼠骨β-catenin、Runx2 mRNA含量：于術(shù)后14周處死小鼠，用Trizol試劑盒體外提取骨組織總RNA，以適量cDNA為模板擴(kuò)增β-catenin、Runx2 mRNA片段。β-catenin引物序列：上游為5’-CACCATGCACCACCACCTCGAAT-3’，下游為5’-GCTTCCGTCAGCGTCAACACCAT-3’，擴(kuò)增片段長度86 bp。Runx2引物序列：上游為5’-GCTGGGACCCTTCACAACCTT-3’，下游為5’-GCTGGGATGCCACCAGACTTA-3’，擴(kuò)增片段長度74 bp。內(nèi)參β-actin引物序列：上游為5’-CGG ACACGGACAGGATTGACA-3’，下游為5’-CCAGACAAATCGC TCCACCAACTA-3’，擴(kuò)增片段長度94 bp，反應(yīng)條件均為95 ℃ 1 min、95 ℃ 10 s、64 ℃ 25 s，40個循環(huán)，72 ℃延伸25 s。每個樣品重復(fù)3次，基因的相對表達(dá)水平以2（Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 Western blot技術(shù)檢測小鼠骨β-catenin、Runx2蛋白含量：采用蛋白提取試劑盒進(jìn)行樣品總蛋白的提取，然后采用BCA定量試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。配制10%分離膠和4%濃縮膠。PVDF膜甲醇中浸泡20 s，然后轉(zhuǎn)移到Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液（5%甲醇）中平衡至少5 min；SDS-PAGE膠在Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液平衡至少30 min；在冷卻條件下以100 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，放到T-TBS室溫封閉1 h，然后T-TBS漂洗3次，每次5 min。一抗以1:1 000溶于T-TBS，4 ℃孵育過夜；然后T-TBS漂洗4次每次5 min；內(nèi)參β-actin以1:2 000溶于T-TBS中。二抗以1:5 000溶于T-TBS，室溫1 h孵育；然后T-TBS漂洗5次每次5 min。采用SuperSignal?West Dura Extended Duration Substrate，制備約1 mL ECL工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1 min，然后去除多余ECL試劑，保鮮膜密封，暗盒中放上X-ray film曝光5～10 min后進(jìn)行顯影和定影。采用Bandscan 5.0軟件分析條帶的光密度值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白（光密度值）/內(nèi)參β-actin（光密度值），重復(fù)測3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)均行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMD測量結(jié)果 手術(shù)14周后，睪丸切除+雄激素替代組和睪丸切除組與假手術(shù)組比較，BMD值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。睪丸切除+雄激素替代組與睪丸切除組比較，BMD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。BMD測量區(qū)域見圖1，因腰椎BMD單樣本重復(fù)測量偏差較大，本實(shí)驗(yàn)未采納腰椎BMD數(shù)值。

表1 3組小鼠BMD測量結(jié)果（n=10，±s，g/cm2）

表1 3組小鼠BMD測量結(jié)果（n=10，±s，g/cm2）

與假手術(shù)組比：aP＜0.05；與睪丸切除組比：bP＜0.05

組別左股骨右股骨假手術(shù)組0.34±0.030.34±0.05睪丸切除組0.28±0.04a0.25±0.06a睪丸切除+雄激素替代組0.29±0.03ab0.27±0.04ab

圖1 BMD測量區(qū)域

2.2 小鼠性激素測定 睪丸切除組小鼠雌、雄激素含量均小于假手術(shù)組和睪丸切除+雄激素替代組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；假手術(shù)組和睪丸切除+雄激素替代組比較雌、雄激素含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 3組小鼠mRNA定量檢測結(jié)果 睪丸切除+雄激素替代組和睪丸切除組與假手術(shù)組比較，β-catenin和Runx2 mRNA含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；睪丸切除組與睪丸切除+雄激素替代組比較，β-catenin和Runx2 mRNA含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表2 3組小鼠性激素含量（n=10，±s，pg/mL）

表2 3組小鼠性激素含量（n=10，±s，pg/mL）

與假手術(shù)組比：aP＜0.05；與睪丸切除組比：bP＜0.05

組別雄激素雌激素假手術(shù)組431.83±54.8532.79±2.61睪丸切除組 64.05±11.56a28.60±4.74a睪丸切除+雄激素替代組460.08±63.69b31.48±3.98b

表3 3組小鼠β-catenin和Runx2 mRNA含量（n=10，±s）

表3 3組小鼠β-catenin和Runx2 mRNA含量（n=10，±s）

與假手術(shù)組比：aP＜0.05；與睪丸切除組比：bP＜0.05

組別β-cateninRunx2假手術(shù)組107.15±17.5732.50±8.22睪丸切除組 52.18±14.56a7.92±2.07a睪丸切除+雄激素替代組 93.13±10.04ab14.28±2.85ab

2.4 3組小鼠Western blot檢測結(jié)果 睪丸切除+雄激素替代組和睪丸切除組與假手術(shù)組比較，β-catenin和Runx2蛋白含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；睪丸切除組與睪丸切除+雄激素替代組比較，β-catenin和Runx2蛋白含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4和圖2。

表4 3組小鼠β-catenin和Runx2蛋白含量（n=10，±s）

與假手術(shù)組比：aP＜0.05；與睪丸切除組比：bP＜0.05

組別β-cateninRunx2假手術(shù)組0.82±0.0280.75±0.037睪丸切除組0.12±0.019a0.36±0.031a睪丸切除+雄激素替代組0.18±0.021ab0.39±0.033ab

圖2 3組小鼠β-catenin和Runx2 Western blot檢測結(jié)果

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)各種原因引起的骨質(zhì)疏松與Wnt/βcatenin信號通路有關(guān)。GONG等[6]研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松-假神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征（Osteoporosis-pseudoglioma syndrome，OPPG）就是因?yàn)閃nt/β-catenin上游的LRP5基因突變，導(dǎo)致該通路抑制形成的一種以影響骨量和視覺為主要臨床表現(xiàn)的隱性遺傳病。王燕等[7]研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠手術(shù)后4周和8周骨量即明顯下降，β-catenin、Runx2的表達(dá)均明顯降低。PORTAL-Nú?EZ等[8]研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠注射鏈脲佐菌素，形成糖尿病大鼠模型，其骨量明顯降低，β-catenin的表達(dá)數(shù)量不僅降低，而且進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用的β-catenin數(shù)量明顯減少，證明了糖尿病引起的骨質(zhì)疏松不僅使β-catenin表達(dá)的數(shù)量明顯減少，Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)也發(fā)生了障礙。

對于雄性動物Wnt/β-catenin信號通路與骨質(zhì)疏松關(guān)系的研究較少。LU等[9]研究發(fā)現(xiàn)給雄性幼鼠喂食高熱量的食物，形成肥胖癥的同時骨量亦會減少，這是由于成骨細(xì)胞的分化受到了影響，其股骨β-catenin和Runx2的表達(dá)減少，認(rèn)為骨量的減少與β-catenin和Runx2信號通路的抑制有關(guān)。CHEN等[10]研究發(fā)現(xiàn)肥胖引起的快速生長期的雄鼠的骨量減少與過氧化物酶增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）的激活和Wnt/β-catenin信號通路的抑制有關(guān)。但是這些研究主要針對幼年雄鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Wnt/ β-catenin信號通路可能影響雄鼠的峰值骨量，但對于已經(jīng)達(dá)到峰值骨量的老年鼠，Wnt/β-catenin信號通路是不是參與其骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在去睪丸后，β-catenin的表達(dá)明顯降低，而使用雄激素替代治療后，β-catenin的表達(dá)升高，受Wnt/β-catenin信號通路影響的Runx2的表達(dá)也增加，這表明Wnt/β-catenin信號通路參與了去睪丸小鼠的骨重建過程，提示去睪丸小鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展可能與Wnt/β-catenin信號通路被抑制有關(guān)聯(lián)。但是雖然使用雄激素替代使Wnt/ β-catenin信號通路的表達(dá)增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異，但具體數(shù)值增加不大，這可能是實(shí)驗(yàn)時間不足的原因，也可能是雄激素本身不能大量地增加Wnt/ β-catenin信號通路的表達(dá)。并且實(shí)驗(yàn)小鼠睪丸切除+雄激素替代組BMD的增加不明顯，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)時間較短，骨量的增加需要較長時間才能在X線下表現(xiàn)，也可能是單純補(bǔ)充雄激素對骨量的大量增加不起決定性作用。

目前，已經(jīng)有調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來治療骨質(zhì)疏松的藥物正在進(jìn)行動物或臨床試驗(yàn)，動物實(shí)驗(yàn)的受試對象為去卵巢小鼠或特定模型鼠，臨床試驗(yàn)的受試對象為絕經(jīng)后女性，未見雄性參與此類試驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn)了原發(fā)性男性骨質(zhì)疏松癥可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，為將來從該通路入手研制抗骨質(zhì)疏松藥物治療原發(fā)性老年男性骨質(zhì)疏松癥提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯：趙翠翠）

Wnt/β-catenin signaling pathway is involved in the osteoporosis of elder mice

RUAN Liqi, HUANG Bo.
Second Department of Orthopaedics, the 117th Hospital of People’s Liberation Army, Hangzhou, 310013

Objective:To evaluate the potential pole of Wnt/beta-catenin signaling pathway in the induction and development of osteoporosis within elder mice.Methods:Healthy ICR mice were randomly divided into three groups, including sham-operated group (n=10), orchiectomy (ORX) group (n=10) and ORX+androgen group (n=10). Testicles were removed from the mice within ORX group and ORX+androgen group. In shamoperated group, the surgery to separate the testicular capsula was performed and the testicles were intact. After surgery, all the mice were fed for 14 weeks freely with water and food under the same condition. The mice were subjected to the evaluation of the bone mineral density (BMD). The blood samples were collected from heart to examine the expression level of estrogen and androgen by an ELISA method. The bone tissues were obtained. The expression levels of β-catenin and Runx2 mRNA expression were determined by real-time PCR while the expression levels of β-catenin and Runx2 protein were evaluated by Western blot.Results:The BMD in the mice of ORX group was signifi cantly decreased compared with NS group (P＜0.05). The expression levels of both β-catenin and Runx2 in the mice of ORX group were also signifi cantly decreased compared with sham-operated group (P＜0.05). The mice in ORX+androgen group showed no signifi cant difference from ORX group (P＞0.05) in BMD. The treatment of androgen could enhance the expression levels of β-catenin and Runx2 in ORX group.Conclusion:Wnt/β-catenin signaling pathway is inhibited 14 weeks after orchiectomy in osteoporosis mice, which can be involved in the induction and development of the osteoporosis.

orchiectomy; mice; osteoporosis; Wnt/β-catenin signaling pathway

R332

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.07.011

2016-05-08

阮立奇（1988-），男，浙江安吉人，住院醫(yī)師，碩士。

黃波，副主任醫(yī)師，Email：huangbo6737@163.com。