洪瓊川　唐綺玲　邁進(jìn)

[摘要]目的 明確TNF-α引起人肺鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT改變并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在相關(guān)機(jī)制。方法 采用TNF-α處理后的人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞，通過劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)方法檢測腫瘤細(xì)胞運(yùn)動、遷移及侵襲能力，采用Western blot方法檢測細(xì)胞是否發(fā)生EMT（標(biāo)志物Vimentin和E-cadherin）改變。結(jié)果 TNF-α能促進(jìn)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞的運(yùn)動、遷移、侵襲能力，且能使細(xì)胞發(fā)生EMT改變，上皮標(biāo)志物E-cadherin降低，間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)升高。結(jié)論 TNF-α能夠誘導(dǎo)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞發(fā)生EMT改變從而具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。

[關(guān)鍵詞]肺鱗癌；TNF-α；EMT；轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）06（a）-0013-04

[Abstract]Objective To clarify the potential mechanism of TNF-α inducing human squamous cell carcinoma of lung to produce EMT changing and promoting the invasion and metastasis of carcinoma cells.Methods SK-MES-1 cells of Human lung squamous cell carcinoma treated with TNF-α，and the motion，migration and invasion ability of lung cancer cells were detected by Scratch-wound assay and Transwell chamber assay，and Western blot was performed to examine whether the cell producing EMT change or not （markers Vimentin and E-cadherin）.Results TNF-α could promote the motion，migration and invasion ability of SK-MES-1 cells of Human lung squamous cell carcinoma，and could make the cell produce EMT change，the epithelial marker （E-cadherin） decreased and the expression of the mesenchymal marker （Vimentin） increased.Conclusion TNF-α can induce EMT change in squamous cell carcinoma of lung and promote metastasis.

[Key words]Squamous cell carcinoma of lung；TNF-α；EMT；Metastasis

肺癌是全球范圍內(nèi)較為常見的惡性腫瘤類型，在我國其發(fā)生率及死亡率均位居惡性腫瘤首位。肺癌中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）占80%以上，包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等[1]。雖然現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)飛速發(fā)展，但是大多數(shù)患者在確診時已為中晚期，失去手術(shù)切除治愈的機(jī)會[2]，且術(shù)后患者復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高[3]，導(dǎo)致肺癌的治療效果差，5年生存率較低[4]。

上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，TNF-α能促進(jìn)多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[5-6]，其機(jī)制可能與EMT的發(fā)生有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)研究意在探討TNF-α對人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞發(fā)生EMT及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并了解其內(nèi)在可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞株在37℃條件下在濃度為5%的 CO2培養(yǎng)箱中放入含有胎牛血清的培養(yǎng)基中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每周2～3次。以人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，TNF-α（10 ng/ml）處理組為實(shí)驗(yàn)組，TNF-α（-）未處理組為對照組。

1.2 細(xì)胞劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)觀察TNF-α（10 ng/ml）對人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞的運(yùn)動能力的影響

①實(shí)驗(yàn)組：TNF-α（10 ng/ml）處理組；對照組：TNF-α（-）未處理組。

②常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于平板中，分別在兩組細(xì)胞的平板中利用槍頭尖（2.5 μl）輕輕劃出痕跡，然后采用標(biāo)記筆將劃痕處進(jìn)行標(biāo)記。待使用PBS緩沖液將細(xì)胞進(jìn)行沖洗后，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，時間為24 h，利用倒置相差顯微鏡對劃痕處的間細(xì)胞距離進(jìn)行觀察，并對細(xì)胞的運(yùn)動能力進(jìn)行判斷。

1.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測TNF-α（10 ng/ml）干預(yù)后對人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞遷徙及侵襲能力的影響

1.3.1實(shí)驗(yàn)組 TNF-α（10 ng/ml）處理組；對照組：TNF-α（-）未處理組。

1.3.2遷移實(shí)驗(yàn) ①取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備無血清細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)為2×105/ml。每組均分別加入100 μl細(xì)胞懸液于上室，并在下室中加入500 μl濃度為10%的FBS開始培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱，時間為24 h。②將下室中的培養(yǎng)基吸去，然后采用棉簽對上室的內(nèi)膠，采用PBS緩沖液進(jìn)行清洗，并利用濃度為4%的多聚甲醇將其進(jìn)行固定處理，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下（×100），每張膜取上、下、左、右、中 5 個視野計(jì)數(shù)連續(xù)5次進(jìn)行拍照，求取平均值。

1.3.3侵襲實(shí)驗(yàn) ①取無血清培養(yǎng)基，總量為200 μl，向其中加入50 μl Matrigel膠模仿基底膜，構(gòu)建侵襲性檢測系統(tǒng)，混勻，4℃操作，向上室各加入60 μl；放入37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時間為4～5 h。②同遷移實(shí)驗(yàn)步驟。

1.4 EMT相關(guān)標(biāo)志物（E-cadherin，Vimentin）的檢測

為了明確TNF-α（10 ng/ml）對人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞的標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的影響，采用Western blot檢測TNF-α（10 ng/ml）處理人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞不同時間（0、1、3、5 h）時E-cadherin，Vimentin的表達(dá)情況。

1.4.1實(shí)驗(yàn)組 TNF-α（10 ng/ml）處理組；對照組：TNF-α（-）未處理組。

1.4.2細(xì)胞總蛋白的提取 ①將培養(yǎng)瓶中陳舊的培養(yǎng)基棄除后采用PBS緩沖液對細(xì)胞洗滌3次，并采用掛勺將細(xì)胞輕輕刮掉；②向其中加入PBS緩沖液吹打，劑量為1 ml，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml預(yù)冷的Ep管中，離心分離，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，時間為2 min；③將上清液撇去后采用細(xì)胞裂解液處理，混合均勻后放置于冰中，時間為30 min，并且需要每間隔4 min進(jìn)行混合操作；④4℃ 12 000 r/min離心5 min；⑤取上清液并將其置于全新的Ep管中，并且在-80℃的恒溫冰箱中保存。

1.4.3 BCA法蛋白定量 ①首先需要根據(jù)樣品的數(shù)量，向其中加入適量的工作液，并且將其混合均勻；②在完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中加入10 ml濃度為0.9%的氯化鈉溶液并將其按照100∶1比例進(jìn)行稀釋，終濃度需要調(diào)整為0.5 mg/ml；③將標(biāo)準(zhǔn)品依次介入培養(yǎng)辦中，并且需要向其中加入稀釋液；④在96孔培養(yǎng)辦中添加標(biāo)準(zhǔn)品，并且需要將其進(jìn)行稀釋處理，然后向其中加入BCA工作液，在37℃的條件下放置30 min；⑤在波長570 nm的條件下對各個小孔的OD值進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后對各組的蛋白濃度進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。

1.4.4 Westen blot檢測各蛋白表達(dá) 采用Westen blot的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法測定兩組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin的表達(dá)情況。（抗體：美國Cell signal公司的Vinment抗體，美國Santan Cruz公司的E-cadherin抗體，及相關(guān)的二抗IG/FITC，二抗IG/TRITC ），利用Image J軟件對各種蛋白的相對含量進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 15.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本和多樣本比較分別采用t檢驗(yàn)和方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

TNF-α作用細(xì)胞24 h后，TNF-α處理組中，細(xì)胞的遷移速度比對照組明顯加快（圖1）。

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)中，處理組和對照組細(xì)胞數(shù)分別是（257±29）、（118±14）個，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；侵襲實(shí)驗(yàn)中，TNF-α處理后兩組的細(xì)胞數(shù)分別為（98±5）、（61±6）個，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α（10 ng/ml）處理組中，上皮標(biāo)志物E-cadherin降低，間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)升高，表明TNF-α誘導(dǎo)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞發(fā)生EMT變化（圖3）。

3 討論

肺鱗癌是最常見的惡性腫瘤之一， 在疾病晚期發(fā)生腫瘤細(xì)胞血管及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高并且危險性也較為嚴(yán)重[7]，在該病發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中存在有多種基因和多種物質(zhì)因子的改變[8-9]。TNF-α是一種單核因子，分子質(zhì)量為26kD的跨膜小分子蛋白，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，屬于炎癥調(diào)節(jié)因子之一，是腫瘤微環(huán)境中重要的組成部分，多項(xiàng)研究表明TNF-α在炎癥、免疫、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及腫瘤增殖，血管形成，侵襲和轉(zhuǎn)移等進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。

EMT即上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，上皮細(xì)胞是高度有序均一的單層細(xì)胞，其主要特點(diǎn)為彼此之間緊密附著，當(dāng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞時，則形態(tài)各異，表現(xiàn)出更多的遷移和侵襲能力[12]。EMT作為肺鱗癌轉(zhuǎn)移過程中的重要階段，尤其是在發(fā)生轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的運(yùn)動細(xì)胞的前緣的出現(xiàn)頻率最高[13-14]，并且上皮細(xì)胞標(biāo)志物丟失，故此間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物水平升高，是惡性腫瘤患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程中向血管侵襲的根本條件[15-16]。

本研究中觀察TNF-α對人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響，以期對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步了解。首先，通過細(xì)胞劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)觀察到經(jīng)TNF-α作用后的人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞的運(yùn)動速度比對照組（未用TNF-α處理組）明顯加快；其次，通過Transwell的遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TNF-α作用細(xì)胞組的遷移和侵襲能力較對照組明顯增強(qiáng)（P<0.05）；最后，檢測實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)量，經(jīng)TNF-α作用后細(xì)胞發(fā)生EMT改變，上皮標(biāo)志物E-cadherin降低，間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)升高，提示TNF-α可能通過誘導(dǎo)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞發(fā)生EMT改變而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、遷移及侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)可以從以下方面進(jìn)行更進(jìn)一步的研究：TWIST是調(diào)控EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌及其他腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)該因子能夠增強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[17]，且很可能與誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)；而TNF-α能夠上調(diào)TWIST的表達(dá)水平，借此誘導(dǎo)EMT發(fā)生改變，還可增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動、轉(zhuǎn)移和侵襲能力；在該病理變化過程中，NF-κB作為關(guān)鍵性的誘導(dǎo)因子，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和生存能力，在其中起至關(guān)重要的作用，因而抑制NF-κB表達(dá)能夠?qū)NF-α的作用產(chǎn)生抑制效應(yīng)，進(jìn)而能夠減輕該因子對腫瘤細(xì)胞增殖能力的提升作用，因此，可以通過檢測NF-κB信號通路的活性、利用免疫熒光、Western blot、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，進(jìn)一步證實(shí)TNF-α可能通過激活經(jīng)典的NF-κB信號通路，從而導(dǎo)致TWIST表達(dá)升高，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT及增強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展是多種因素、多種基因參與和作用的結(jié)果[18-19]。TNF-α可能通過誘導(dǎo)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞發(fā)生EMT改變而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、遷移及侵襲能力只是其中一種可能的機(jī)制，仍需要更多的臨床及實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：2017-04-18 本文編輯：許俊琴）