劉軍 甄平 周勝虎 田琦 陳慧 王偉 何曉樂 李旭升*

1.蘭州軍區(qū)總醫(yī)院全軍骨科中心關(guān)節(jié)外科， 甘肅 蘭州 730050 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750000 3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710032

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為病理性特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病，臨床表現(xiàn)以關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹、畸形等功能障礙為主[1]，易導(dǎo)致老年人疼痛和傷殘，進(jìn)而嚴(yán)重影響日常工作和生活。持續(xù)的軟骨細(xì)胞凋亡、滑膜炎和骨破壞等致使OA患者病情進(jìn)行性加重[2]，OA發(fā)病時(shí)血清及關(guān)節(jié)液的多種炎癥介質(zhì)(白細(xì)胞介素、單核細(xì)胞趨化蛋白和腫瘤壞死因子等)明顯增加，炎性因子的浸潤(rùn)在關(guān)節(jié)軟骨的降解中貫穿始終[3]。基于以上理念，深入探討OA病理過程中的發(fā)病機(jī)制對(duì)OA中早期的干預(yù)尤為重要。本研究通過觀察不同劑量腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)在構(gòu)建大鼠OA模型中對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，初步探討大鼠骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用，以期為早期干預(yù)OA提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品和試劑

SPF級(jí)SD大鼠(雄性20只，體質(zhì)量為221.50～252.90 g，平均230.60±12.00 g)由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；DMEM 低糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；二甲亞砜(DMSO)和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；腫瘤壞死因子-α、蛋白酶抑制劑和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP羊抗小鼠、羊抗兔和兔抗羊IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RIPA裂解液和蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 OA模型的制備和實(shí)驗(yàn)分組

將將20只SPF級(jí)SD大鼠雄性隨機(jī)分為健康對(duì)照組、TNF-α 1ng/mL干預(yù)組、TNF-α 5ng/mL干預(yù)組和TNF-α 10ng/mL干預(yù)組，根據(jù)各分組要求，分別于第1天及第7天給予1 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL濃度的TNF-α注射入大鼠關(guān)節(jié)腔。4周后用脫頸法處死所有小鼠。

1.3 軟骨細(xì)胞的提取及培養(yǎng)

將四組分別分離的膝關(guān)節(jié)軟骨組織置于培養(yǎng)瓶中，置于1 mg/mL膠原酶Ⅰ的HEPES液(硫酸鎂溶液 0.8 mmol/L、氯化鎂溶液 116.0 mmol/L、氯化鉀溶液 5.4 mmol/L、磷酸氫鈉溶液 10.0 mmol/L、葡萄糖 5.1 mmol/L、HEPES 20.0 mmol/L，酸堿度值7.3)中消化，重復(fù)消化三次，每次3～5 min。用含10%血清的DMEM溶液終止消化，置于低速離心機(jī)中離心，相對(duì)離心力為200×g，5 min。棄去上清液，用含10%血清和0.01 mmol/L的DMEM溶液重懸細(xì)胞。用200目的篩網(wǎng)過濾沒有貼壁的細(xì)胞，去除未消化的組織塊。收集過濾的細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶進(jìn)行原代培養(yǎng)。然后，分別取部分原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理，收集第2、3、4、5代的細(xì)胞，分別以2×103個(gè)細(xì)胞每孔種于96孔板測(cè)生長(zhǎng)曲線，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況最終選取第3代的軟骨細(xì)胞進(jìn)行下一步處理。傳代細(xì)胞使用前進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定，具體操作為將傳代細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，接種于放置有細(xì)胞爬片玻片的24孔板中，待細(xì)胞爬片48 h后用PBS沖洗并用4%多聚甲醛固定，然后用1%甲苯胺藍(lán)染色30 min，無水乙醇漂洗后室溫干燥，取下玻片置于載玻片并封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確認(rèn)其為軟骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)以確認(rèn)軟骨細(xì)胞純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.4 MTT法檢測(cè)不同劑量TNF-α處理后軟骨細(xì)胞活力

將原代軟骨細(xì)胞按2×103個(gè)/mL接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入上述不同濃度的TNF-α，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，每濃度重復(fù)8孔。各組細(xì)胞孵育8 h后，棄去培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)液(100 μL)和含0．5% MTT的培養(yǎng)液(10 μL)，37 ℃、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO原液，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后拍照，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(λ=492 nm)，記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ELISA法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1水平

按照ELISA試劑盒說明書要求測(cè)定sICAM-1水平變化。

1.6 TUNEL法凋亡檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡率

取大鼠膝關(guān)節(jié)股骨外髁靠髁間窩同一部位組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h；軟骨細(xì)胞則直接用4%多聚甲醛中固定30 min后PBS洗3遍，進(jìn)行打孔；軟骨組織常規(guī)脫水、包埋、切片、脫蠟。軟骨細(xì)胞爬片用4%甲醛固定30 min。上述處理后的軟骨組織或細(xì)胞用PBS振蕩洗片，5 min，3次。滴加Triton X-100(0.1%)打孔3 min后PBS振蕩洗片，5 min，3次。然后嚴(yán)格按照Roche公司TUNEL檢測(cè)試劑盒操作，1號(hào)和2號(hào)液按照1∶9配置，避光37 ℃孵育1 h，PBS振蕩洗片，5 min，3次。DAPI染細(xì)胞核2 min，PBS振蕩洗片，5 min，3次。50%甘油封片，熒光顯微鏡照相，其中TUNEL染的凋亡細(xì)胞核發(fā)綠光，DAPI染的所有細(xì)胞核發(fā)藍(lán)光。以綠色熒光的細(xì)胞數(shù)與藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)的百分比(%)表示凋亡細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞數(shù)的比例。

1.7 蛋白印跡法檢測(cè)MMP9、ICAM1、IRE1、p-IRE1及GRP78的表達(dá)水平

蛋白印跡法測(cè)定軟骨細(xì)胞中MMP9、ICAM1、IRE1、p-IRE1及GRP78的含量，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉，洗膜，加入1∶600稀釋的兔抗大鼠MMP9、ICAM1、IRE1、p-IRE1及GRP78一抗，4 ℃下過夜，用洗膜液漂洗后加入1∶1000稀釋的二抗，搖床1 h，TBST沖洗三遍，每次5 min，后用電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescence，ECL)液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)拍照，上機(jī)檢測(cè)用所帶電腦軟件進(jìn)行條帶灰度值的分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同劑量TNF-α 處理對(duì)OA軟骨細(xì)胞活力的影響

與Control組相比，TNF-α 1ng/mL干預(yù)組、TNF-α 5ng/mL干預(yù)組和TNF-α 10ng/mL干預(yù)組對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響(P>0.05)。TNF-α 1ng/mL干預(yù)組、TNF-α 5ng/mL干預(yù)組和TNF-α 10ng/mL干預(yù)組之間兩兩比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。如圖1。

圖1 不同劑量TNF-α處理對(duì)OA軟骨細(xì)胞活力的影響。注：結(jié)果用mean±SEM，n=8，TNF-α：腫瘤壞死因子-α；OD value：吸光值。Fig.1 The effect of different doses of TNF-α on OA chondrocyte viability.The results are mean±SEM, n=8.TNF-α: tumor necrosis factor-α; OD value: optical density value

2.2 ELISA法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞sICAM-1水平變化

與Control組相比，TNF-α 1ng/mL干預(yù)組、TNF-α 5ng/mL干預(yù)組和TNF-α 10ng/mL干預(yù)組sICAM-1含量表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且呈濃度依賴性升高；TNF-α不同濃度組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示TNF-α干預(yù)后可使軟骨細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平增高，其中當(dāng)TNF-α濃度為10ng/mL增高最為明顯。如圖2。

圖2 不同劑量TNF-α處理組軟骨細(xì)胞sICAM-1水平變化aaP<0.01 vs.對(duì)照組，bbP<0.01 vs.1ng/mL組，ccP<0.01 vs.5 ng/mL組Fig.2 The effect of different doses of TNF-α on sICAM-1 levels of OA chondrocytes.aaP<0.01 vs.Control group，bbP<0.01 vs.1ng/mL group，ccP<0.01 vs.5 ng/mL group

2.3 不同劑量TNF-α處理對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡率的影響

圖3 不同劑量TNF-α處理對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡率的影響上圖為各組軟骨細(xì)胞處理后典型TUNEL染色照片，藍(lán)染為細(xì)胞核，綠染為凋亡細(xì)胞。下圖為細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)分析圖。結(jié)果用mean±SEM，n=8，aaP<0.01 vs.對(duì)照組，bbP<0.01 vs.1ng/mL組，ccP<0.01 vs.5 ng/mL組。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；Apoptotic index：凋亡率。Fig.3 The effect of different doses of TNF-α on the apoptosis rate of OA chondrocytesThe figure on top shows the photos of each group of chondrocytes treated with typical TUNEL staining, blue dye for the nucleus, green staining for apoptotic cells.The picture at bottom shows the statistical analysis of apoptosis rate.Values are mean±SEM, n=8, aaP<0.01 vs.control group, bbP<0.01 vs.1 ng/mL group, ccP <0.01 vs.5 ng/mL group.TNF-α: Tumor necrosis factor-α; Apoptotic index: Apoptosis rate.

TUNEL檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，如圖所示，與Control 組(8.05±1.60%)相比，TNF-α 1 ng/mL處理可顯著增高軟骨細(xì)胞凋亡率至25.30±3.10%(P<0.01)，TNF-α 5 ng/mL處理顯著增高軟骨細(xì)胞凋亡率至36.05±3.55%(P<0.01)，TNF-α 10 ng/mL處理顯著增高軟骨細(xì)胞凋亡率至49.02±5.08%(P<0.01)。TNF-α不同濃度組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示TNF-α干預(yù)后可促使軟骨細(xì)胞凋亡率增高，其中當(dāng)TNF-α濃度為10ng/mL時(shí)促凋亡作用最為明顯。如圖3。

圖4 不同劑量TNF-α處理組MMP9、ICAM1蛋白表達(dá)水平變化aaP<0.01 vs.對(duì)照組，bbP<0.01 vs.1 ng/mL組，ccP<0.01 vs.5 ng/mL組Fig.4 The effect of different doses of TNF-α on the protein expression levels of MMP9 and ICAM1aaP<0.01 vs.Control group，bbP<0.01 vs.1 ng/mL group，ccP<0.01 vs.5 ng/mL group

2.4 各組軟骨細(xì)胞MMP9、ICAM1蛋白表達(dá)水平變化

與Control組相比，TNF-α 1ng/mL干預(yù)組、TNF-α 5ng/mL干預(yù)組和TNF-α 10ng/mL干預(yù)組中軟骨細(xì)胞的MMP9、ICAM1蛋白表達(dá)水平變化均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且呈濃度依賴性升高；TNF-α不同濃度組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示TNF-α干預(yù)后可使軟骨細(xì)胞的MMP9、ICAM1蛋白表達(dá)水平增高，其中當(dāng)TNF-α濃度為10ng/mL增高最為明顯。如圖4。

2.5 各組軟骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)IRE1、p-IRE1及RP78的蛋白表達(dá)變化

與Control組相比，TNF-α 1ng/mL干預(yù)組、TNF-α 5ng/mL干預(yù)組和TNF-α 10ng/mL干預(yù)組中軟骨細(xì)胞的IRE1、p-IRE1及RP78蛋白表達(dá)水平變化均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且呈濃度依賴性升高；TNF-α不同濃度組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示TNF-α干預(yù)后可使軟骨細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)水平增高，其中當(dāng)TNF-α濃度為10ng/mL增高最為明顯。如圖5。

圖5 不同劑量TNF-α處理組IRE1、p-IRE1及RP78的蛋白表達(dá)變化aaP<0.01 vs.對(duì)照組，bbP<0.01 vs.1 ng/mL組，ccP<0.01 vs.5 ng/mL組Fig.5 The effect of different doses of TNF-α on the protein expression levels of IRE1, p-IRE and RP78aaP<0.01 vs.Control group，bbP<0.01 vs.1 ng/mL group，ccP<0.01 vs.5 ng/mL group

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和功能行使方面起著重要的作用，內(nèi)外環(huán)境中多種刺激因素: 炎癥、組織低氧、氧化還原損傷、蛋白質(zhì)包涵體和病毒性感染等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白積聚，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，這個(gè)過程稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[4]。ERS是引起細(xì)胞凋亡的一條重要通路，在有因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，未折疊蛋白反應(yīng)可以減少未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的聚集，從而減除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力，當(dāng)這些變化不能緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的壓力時(shí)，則會(huì)引起細(xì)胞凋亡[5]。ERS參與一系列生理和病理過程，包括糖尿病、腫瘤、神經(jīng)退行性變等，并且和炎癥通路也存在著交互調(diào)控。以及相應(yīng)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR) 涉及整個(gè)細(xì)胞周期，貫穿于機(jī)體的一系列生理、病理過程和多種疾病之中[6,7]。有學(xué)者通過對(duì)傳代軟骨細(xì)胞的低糖性損傷處理發(fā)現(xiàn)，與IRE1 相關(guān)的p38/MAPK信號(hào)通路能增強(qiáng)軟骨炎癥時(shí)的關(guān)節(jié)破壞[8]。IRE1 是ERS 和UPR的三條通路之一，分子量為100 kDa 的一種跨膜蛋白，具有絲氨酸蘇氨酸結(jié)構(gòu)域和核糖核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。UPR發(fā)生時(shí),IREl 腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域與GRP78 解離，IRE1 寡聚化，引起自身磷酸化從而激活許多與免疫、炎癥和調(diào)亡相關(guān)的蛋白激酶[9]。炎性反應(yīng)中多種細(xì)胞因子可對(duì)骨代謝發(fā)揮直接或者間接影響[10]，如TNF-α可抑制成骨細(xì)胞分化，并通過Fas-FasL途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，以及IL-1、IFN-γ抑制成骨細(xì)胞的膠原合成[11]。

TNF-α是一種非螺旋、富含β-折疊的蛋白多肽，每個(gè)單體由反向平行的β-折疊組成，通常以二聚體、三聚體或五聚體的形式存在于體內(nèi)，具有生物學(xué)活性的TNF-α分子是緊密連接的三聚體[12]。一方面它具有調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能；另一方面則介導(dǎo)細(xì)胞因子分泌、表達(dá)黏附分子增殖炎癥過程、組織損傷、休克等病理生理反應(yīng)[13]。人類TNF-α基因大小為2.76 Kb, 由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成, 與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)緊密連鎖, 定位于第6對(duì)染色體短臂上。鼠TNF-α基因定位于第17對(duì)染色體短臂上，大小為2.78Kb, 與人的結(jié)構(gòu)非常相似[14]。

在骨科領(lǐng)域，TNF-α與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis, PMOP)關(guān)系密切，TNF可刺激成骨細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶活性, 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)、促進(jìn)軟骨細(xì)胞進(jìn)行軟骨更新, 抑制新骨形成[15]。TNF-α基因是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)發(fā)病遺傳因素的一個(gè)重要基因，TNF增強(qiáng)子238 位GG 基因型與RA 進(jìn)展性關(guān)節(jié)破壞程度相關(guān)且不依賴于DR4的存在。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF 區(qū)域多態(tài)性可能與DR 等位基因存在交互作用從而影響疾病易感性[16]。動(dòng)物關(guān)節(jié)模型、體外滑膜細(xì)胞的培養(yǎng)及RA的臨床研究均證實(shí)，大量激活的T、B 淋巴細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞浸潤(rùn)，并分泌大量的細(xì)胞因子及趨化因子[17]，易導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥反應(yīng)及免疫損傷等發(fā)生。TNF-α具可刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2，增加軟骨下骨的吸收，引起關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的破壞。Singh等[18]研究顯示2-羥基-苯甲酰胺抑制受腫瘤壞死因子α刺激的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，2-羥基-苯甲酰胺抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶13的活性及腫瘤壞死因子α調(diào)節(jié)的Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解。

在骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)中, 約50%患者的滑液中可檢測(cè)到高水平TNF-α。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明, OA早期的滑液中即可檢測(cè)出高水平TNF。體外滑膜細(xì)胞及滑液中單核細(xì)胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)存在可自發(fā)分泌高水平TNF的現(xiàn)象, 并因刺激因素的存在而含量增高[19]。TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠可持續(xù)表達(dá)TNF-α, 發(fā)生關(guān)節(jié)炎性病變, 抗TNF-α抗體能減輕轉(zhuǎn)基因小鼠及膠原誘導(dǎo)模型小鼠的炎癥。江鋒及麥鴻飛等[20,21]研究小組分別就TNF-α在OA患者血清與關(guān)節(jié)液中含量加以對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α水平隨膝OA嚴(yán)重性指數(shù)的增加而升高，含量與關(guān)節(jié)病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.449，P=0.006)，且丙二醛和TNF-α水平存在線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.858(P< 0.01)。據(jù)于以上研究，目前國內(nèi)外較為一致的觀點(diǎn)為TNF-α是目前RA治療的主要靶標(biāo)之一。

本試驗(yàn)中我們通過觀察不同劑量TNF-α在構(gòu)建大鼠骨OA模型中對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響中發(fā)現(xiàn)：不同劑量的TNF-α處理對(duì)OA軟骨細(xì)胞活力的影響無顯著差異，TNF-α干預(yù)后可使軟骨細(xì)胞sICAM-1表達(dá)水平增高，且其增高水平呈TNF-α濃度依賴性變化；在軟骨細(xì)胞的凋亡檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α干預(yù)濃度的升高，軟骨細(xì)胞的凋亡率隨之增加；蛋白印記法檢測(cè)結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，軟骨細(xì)胞的p-IRE1、IRE1、GRP78、MMP9及ICAM1的表達(dá)水平呈TNF-α濃度依賴性升高。本研究結(jié)果揭示TNF-α在OA病理過程中影響軟骨細(xì)胞炎性因子、凋亡等方面的變化，其效應(yīng)可能和作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程相關(guān)，且當(dāng)TNF-α濃度為10ng/mL時(shí)，其作用效果最為顯著。析其作用機(jī)制可能為：①TNF-α受體(TNFR)，尤其是TNFR I(CD120α)導(dǎo)致的促細(xì)胞凋亡活性、抗病毒活性、誘導(dǎo)Mn-SOD、ICAM-1 及IL-6等炎癥因子的表達(dá)、激活NF-κB等多種生物活性物質(zhì)的信號(hào)傳遞，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22,23]；②TNFα可誘導(dǎo)eIF2α磷酸化，上調(diào)ATF4mRNA和CHOP蛋白的表達(dá)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白PERK的激活，誘導(dǎo)UPR中PERK-eIF2α途徑的活化[24]。③TNF-α可以上調(diào)XBP-1 mRNA及IREl、GRP78蛋白的表達(dá)，間接反映了TNFa可以誘導(dǎo)UPR中ATF6途徑和IREI-XBP-1 途徑的活化[25]；④發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的軟骨細(xì)胞對(duì)II型膠原、蛋白聚糖和連接蛋白的mRNA表達(dá)明顯受抑, 并隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步下降；最終ERS通過影響軟骨細(xì)胞的功能和分化，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡, 從而導(dǎo)致各種軟骨細(xì)胞相關(guān)性疾病。

綜上，在TNF-α構(gòu)建大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型中，炎癥因子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)均發(fā)生顯著改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要影響。但其上下游的其他作用分子或信號(hào)通路仍未揭曉，有待于我們進(jìn)一步研究。