張 玲， 王得華， 馬 義， 徐漢虹

(1暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州510632; 2天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

印楝素對(duì)min6細(xì)胞增殖及胰島素分泌的影響

張 玲1,2， 王得華1， 馬 義1， 徐漢虹2

(1暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州510632; 2天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

【目的】研究印楝素對(duì)min6細(xì)胞增殖、葡萄糖攝取及胰島素分泌的影響，并探討其作用機(jī)制?！痉椒ā坎煌瑵舛扔￠靥幚韒in6細(xì)胞48 h，檢測(cè)細(xì)胞增殖量。在5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖條件下，檢測(cè)印楝素處理細(xì)胞的葡萄糖攝取水平，胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞胰島素的分泌?！窘Y(jié)果】與對(duì)照組相比，在5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖條件下，印楝素均表現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖活性。印楝素處理下，與25.0 mmol·L-1葡萄糖條件相比，5.5 mmol·L-1葡萄糖表現(xiàn)出更顯著地促進(jìn)葡萄糖攝取和胰島素分泌的作用?！窘Y(jié)論】印楝素可能通過(guò)調(diào)控葡萄糖水平影響胰島素的分泌。

印楝素； min6細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 胰島素分泌； ELISA檢測(cè)

印楝素是從印楝AzadirachtaIndica種子中提取的檸檬素類(lèi)化合物，屬于四環(huán)三萜類(lèi)化合物，包括10多個(gè)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物[1]。印楝素對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控表現(xiàn)為抑制昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和干擾昆蟲(chóng)的內(nèi)分泌導(dǎo)致其變態(tài)發(fā)育異常[2-3]。印楝素對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控可能涉及多種因素，印楝素能明顯地影響昆蟲(chóng)體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)和脂肪的合成代謝，影響內(nèi)源激素的調(diào)控途徑[4-5]。在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中，胰島素信號(hào)通路參與調(diào)控營(yíng)養(yǎng)代謝物，間接調(diào)控昆蟲(chóng)的變態(tài)生長(zhǎng)發(fā)育[6-7]。在前期研究中，天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)印楝素作用下的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)和離體細(xì)胞差異表達(dá)基因/蛋白文庫(kù)分析，提出了印楝素可能通過(guò)營(yíng)養(yǎng)-胰島素信號(hào)(IIS)途徑調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育[6]。

哺乳動(dòng)物的胰島素是機(jī)體中促進(jìn)合成和代謝的多肽類(lèi)激素。胰島β細(xì)胞是胰島素合成和分泌的主要場(chǎng)所，調(diào)控機(jī)體中糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝等[8-9]。胰島β細(xì)胞合成和分泌胰島素受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等多種因素的調(diào)控，葡萄糖是最主要的調(diào)控因子[10]。本研究在胰島β細(xì)胞min6 細(xì)胞水平，研究印楝素對(duì)胰島素信號(hào)途徑的影響，通過(guò)印楝素對(duì)葡萄糖和胰島素的調(diào)控，探討印楝素可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胰島瘤細(xì)胞min6細(xì)胞，采用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(分別含5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖)培養(yǎng)，15%(φ)胎牛血清臨用前添加， 加入胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、0.1 mg·mL-1鏈霉素、50 μmol·L-1β-巰基乙醇，調(diào)節(jié)pH 至7.35～7.45，在37 ℃，5%(φ) CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

印楝素從印楝素種子中提取，其中印楝素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)>90%，由天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM培養(yǎng)液、0.05%(φ)胰酶-EDTA、胎牛血清均購(gòu)自Gibco 公司;D-(+) -葡萄糖、2β-巰基乙醇、DMSO，購(gòu)自Sigma 公司。ELISA胰島素試劑盒購(gòu)自Linco公司。

KRBH 緩沖液 (1 L)：NaCl 7.54 g；KCl 0.36 g；MgSO40.15 g；KH2PO40.16g；CaCl20.28 g；NaHCO30.42 g；BSA 1.00 g；HEPES 2.38 g；去離子水 1 L，磁力攪拌器混勻后，調(diào)節(jié) pH 7.4，過(guò)濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖測(cè)定 用MTT 法檢測(cè)印楝素對(duì)min6 細(xì)胞增殖活性的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的min6 細(xì)胞，調(diào)整濃度為 2×105mL-1，接種至96 孔板中，每孔加入DMEM 完全培養(yǎng)液150 μL，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗2 次。加入印楝素200 μg·mL-1150 μL，順序加入倍半稀釋濃度，培養(yǎng)48 h 后，每孔加CCK8 20 μL，繼續(xù)孵育4 h; 孵育4 h 后小心吸棄上清液，每孔加入150 μL 的DMSO，振蕩10 min。酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm的光密度值。

1.2.2 min6細(xì)胞葡萄糖攝取量測(cè)定 將min6細(xì)胞以 2×105個(gè)細(xì)胞接種于 12 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，棄去板中培養(yǎng)基，用 KRBH 緩沖液輕柔地洗2次，再用含 100 μg 印楝素的 KRBH 緩沖液繼續(xù)孵育2 h。然后，加入5.5和25.0 mmol·L-1的葡萄糖孵育20 min，收集上清液，通過(guò)檢測(cè)上清液中葡萄糖的含量反映細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收。

1.2.3 min6細(xì)胞內(nèi)胰島素含量的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至2× 105L-1，接種于12孔板， 24 h 后棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用 KRBH 緩沖液輕柔地洗2次，再用 KRBH 預(yù)孵育 2 h，使細(xì)胞對(duì)葡萄糖致敏。然后，換用新鮮的 KRBH 緩沖液分別加入0、50、100、150、200 μg·mL-1印楝素， 以及5.5 或者25.0 mmol·L-1葡萄糖繼續(xù)孵育 1 h，收集上清液，ELISA胰島素試劑盒測(cè)定胰島素的含量。

以上試驗(yàn)均重復(fù)6次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。應(yīng)用Sigmaplot 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素對(duì)min6細(xì)胞增殖的影響

不同濃度印楝素分別作用于高糖培養(yǎng)基(25.0 mmol·L-1葡萄糖)和低糖培養(yǎng)基(5.5 mmol·L-1葡萄糖)培養(yǎng)的min6 細(xì)胞，48 h 后檢測(cè)細(xì)胞存活率。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。不同濃度印楝素分別處理 48 h后，采用CCK8檢測(cè)min6細(xì)胞的存活狀態(tài)。由圖1可知，min6細(xì)胞在高糖和低糖培養(yǎng)基條件下均生長(zhǎng)良好，印楝素均表現(xiàn)出促進(jìn)增殖活性，且表現(xiàn)出一定的濃度依賴(lài)性。印楝素質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時(shí)，在低糖培養(yǎng)基中，增殖率提高20%，而在高糖培養(yǎng)基中，增殖率提高13%。

2.2 印楝素對(duì)min6細(xì)胞葡萄糖攝取的影響

min6細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)，加入緩沖溶液饑餓 2 h 后，分別在5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖新鮮的KRBH緩沖溶液中，用100 μg·mL-1印楝素處理，繼續(xù)培養(yǎng) 20 min，取上清檢測(cè)培養(yǎng)基中葡萄糖的含量。

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，在低糖培養(yǎng)條件下，印楝素處理組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度與無(wú)藥物處理組相比明顯降低，試驗(yàn)檢測(cè)葡萄糖濃度降低11%，表明細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量增加，間接表明印楝素可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收。而在無(wú)糖對(duì)照組中，印楝素處理組與未用藥組沒(méi)有顯著差異。在高糖培養(yǎng)條件下，印楝素處理組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低，與未用藥組比較差異不顯著。

圖1 印楝素對(duì)min6細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of azadirachtin on proliferation of min6 cells

* 表示處理與對(duì)照差異顯著(P<0.05，DMRT法)。

2.3 印楝素對(duì)min6細(xì)胞胰島素分泌的影響

min6細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用KRBH緩沖溶液孵育使細(xì)胞對(duì)葡萄糖致敏，檢測(cè)不同溶度印楝素處理下胰島素的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)min6細(xì)胞在5.5 mmol·L-1葡萄糖環(huán)境中，印楝素對(duì)細(xì)胞的胰島素分泌產(chǎn)生影響，如圖3a所示，當(dāng)印楝素的濃度為50、100、150 μg·mL-1時(shí)，胰島素的分泌量先隨濃度增加，與無(wú)藥對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。然后在印楝素濃度200 μg·mL-1胰島素分泌量增加有所下降，與對(duì)照差異不顯著。 當(dāng)印楝素為100 μg·mL-1時(shí)，胰島素分泌量增加25%。

當(dāng)min6細(xì)胞處于25.0 mmol·L-1葡萄糖環(huán)境中，印楝素同樣表現(xiàn)為促細(xì)胞胰島素分泌，如圖3b所示，與低葡萄糖試驗(yàn)組同樣的4個(gè)印楝素處理濃度，胰島素分泌增加較少，同樣隨印楝素處理濃度增加而胰島素分泌量增加。與低葡萄糖濃度刺激相比，在高葡萄糖濃度刺激下，印楝素處理組促胰島素的分泌量相對(duì)較低。

分泌的胰島素以每小時(shí)計(jì)，* 表示處理與對(duì)照差異顯著(P<0.05，DMRT法)。

3 討論與結(jié)論

昆蟲(chóng)min6細(xì)胞系是胰島素分泌研究中常用的細(xì)胞模型，該模型已經(jīng)具備完善的研究方法和理論基礎(chǔ)，在該細(xì)胞模型中研究印楝素處理下對(duì)葡萄糖以及胰島素分泌的影響，可為后續(xù)的昆蟲(chóng)體系的試驗(yàn)提供理論參考。

在β細(xì)胞中，營(yíng)養(yǎng)因子葡萄糖是刺激胰島素分泌的最主要因素。葡萄糖由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胰島β細(xì)胞，參與生物體血糖的調(diào)節(jié)，因而細(xì)胞中影響葡萄糖代謝的影響因子均對(duì)胰島素的分泌產(chǎn)生影響。因此，選擇胰島β細(xì)胞作為研究印楝素對(duì)營(yíng)養(yǎng)因子及其相關(guān)信號(hào)調(diào)控的研究體系。

在本研究中試驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的印楝素，在5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中，均表現(xiàn)出對(duì)胰島β細(xì)胞不同程度的促增殖作用。在5.5 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中促增殖作用更加顯著。同時(shí)，印楝素在低葡萄糖和高葡萄糖環(huán)境下能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，在5.5 mmol·L-1低葡萄糖條件細(xì)胞攝取更多的葡萄糖。而糖的吸收和代謝是葡萄糖依賴(lài)的胰島素分泌的主要影響因素。影響葡萄糖在β細(xì)胞代謝中的因素均可影響到胰島素的分泌。試驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測(cè)不同濃度印楝素處理的細(xì)胞胰島素分泌水平，在5.5 mmol·L-1低糖培養(yǎng)基中，胰島素分泌水平增加，這與相同條件下試驗(yàn)檢測(cè)的葡萄糖攝取水平一致。作為葡萄糖依賴(lài)的胰島素分泌，胰島素的分泌主要受葡萄糖的刺激影響，葡萄糖的攝取量增加直接導(dǎo)致胰島素的分泌增加。試驗(yàn)結(jié)果顯示印楝素在低葡萄糖環(huán)境中促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，促進(jìn)胰島素的分泌，進(jìn)而推斷印楝素的作用可能是調(diào)控葡萄糖的吸收，間接的產(chǎn)生葡萄糖刺激胰島素分泌的響應(yīng)。而在高葡萄糖環(huán)境中，印楝素促葡萄糖吸收作用減弱，胰島素分泌量沒(méi)有顯著的增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，印楝素作用的胰島β細(xì)胞中，胰島素的分泌和印楝素作用下葡萄糖的吸收結(jié)果一致。因此可以推斷印楝素可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度，進(jìn)而影響到細(xì)胞胰島素的釋放，而不是簡(jiǎn)單作用于胰島素及其受體本身。

在之前的文獻(xiàn)報(bào)道中，印楝素在多種細(xì)胞上均表現(xiàn)出抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用。在昆蟲(chóng)細(xì)胞中，印楝素表現(xiàn)出明顯的抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡[11-12]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，文獻(xiàn)報(bào)道印楝素提取物也表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡等[13-14]。在子宮癌Hela細(xì)胞系中，印楝素顯著地抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。因而，印楝素通常情況下具有抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)作用。本研究結(jié)果表明，min6細(xì)胞在葡萄糖存在條件下，印楝素表現(xiàn)出促增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取以及細(xì)胞胰島素的分泌，因而推斷在min6細(xì)胞中印楝素調(diào)控胰島素分泌可能與印楝素調(diào)控抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制不同。在胰島β細(xì)胞中，葡萄糖-胰島素信號(hào)途徑為主要的調(diào)控通路，而細(xì)胞生長(zhǎng)是通過(guò)PI3K信號(hào)通路調(diào)控的，因而印楝素在胰島β細(xì)胞中可能是通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖合成和代謝中的靶標(biāo)，達(dá)到調(diào)控葡萄糖吸收的目的，間接地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)胰島素的釋放。

文獻(xiàn)報(bào)道番石榴酸在Ins-1胰島β細(xì)胞中表現(xiàn)相似的促細(xì)胞增殖活性和影響胰島素合成和分泌的作用[15]。番石榴酸結(jié)構(gòu)上屬于羥基萜類(lèi)化合物，鑒于印楝素與羥基萜類(lèi)化合物在結(jié)構(gòu)上的相似性，該類(lèi)化合物在葡萄糖-胰島素調(diào)控中的作用機(jī)制研究可以成為印楝素進(jìn)一步研究的參考。

[1] BUTTERWORTH J H, MORGAN E D. Isolation of a substance that suppresses feeding in locusts[J]. J Chem Soc Chem Commun, 1968(1): 23-24.

[2] 李曉東, 趙善歡. 印楝素對(duì)昆蟲(chóng)的毒理作用機(jī)制[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1995, 17(1): 118-122.

[3] MORGAN E D. Azadirachtin, a scientific gold mine[J]. Bioorg Med Chem, 2009, 17: 4096-4105.

[4] MORDUE A J, BLACKWELL A. Azadirachtin: An update[J]. J Insect Physiol, 1993, 39: 903-924.

[5] 查友貴, 徐漢虹. 印楝及印楝生物農(nóng)藥[J]. 世界農(nóng)藥, 2003, 25(4): 29-30.

[6] LAI D, JIN X, WANG H, et al. Gene expression profile change and growth inhibition inDrosophilalarvae treated with azadirachtin[J]. J Biotechnol, 2014, 185: 51-56.

[7] WANG H, LAI D, YUAN M, et al. Growth inhibition and differences in proteinpro files in azadirachtin-treatedDrosophilamelanogasterlarvae[J]. Electrophoresis, 2014, 35(8): 1122-1129.

[8] RITZEL R A. Therapeutic approaches based on beta-cell mass preservation and/or regeneration[J]. Front Biosci, 2009, 14: 1835-1850.

[9] WEIR G C, BONNER-WEIR S. Isletβcell mass in diabetes and how it relates to function, birth, and death[J]. Ann NY Acad Sci, 2013, 1281(1): 92-105.

[10]GEMBAL M, GILON P, HENQUIN J C. Evidence that glucose can control insulin release independently from its action on ATP-sensitive K+channels in mouseβcells[J]. J Clin Invest, 1992, 89(4): 1288-1295.

[11]程杏安, 黃勁飛, 胡美英, 等. 印楝素A誘導(dǎo)Sf9細(xì)胞凋亡的顯微和超微形態(tài)變化[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 31(4): 52-58.

[12]HUANG J F, SHUI K J, LI H Y, et al. Antiproliferative effect of azadirachtin A onSpodopteralituraSl-1 cell line through cell cycle arrest and apoptosis induced by up-regulation of p53[J]. Pestic Biochem Physiol, 2011, 99(1): 16-24.

[13]MAHAPATRA S, KARNES R J, HOLMES M W, et al. Donkena, novel molecular targets ofAzadirachtaindicaassociated with inhibition of tumor growth in prostate cancer[J]. The AAPS J, 2011, 13: 365-377.

[14]GUNADHARINI D N, ELUMALAI P, ARUNKUMAR R, et al. Induction of apoptosis and inhibition of PI3K/Akt pathway in PC-3 and LNCaP prostate cancer cells by ethanolic neem leaf extract[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 134(3): 644-650.

[15]王婧茹, 趙晶晶, 葉春玲, 等. 番石榴葉總?cè)茖?duì)2 型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(6): 1109-1113.

【責(zé)任編輯 霍 歡】

Effects of azadirachtin on proliferation and insulin secretion of min6 cells

ZHANG Ling1,2, WANG Dehua1, MA Yi1, XU Hanhong2

(1 College of Life Science and Technology, Jinan University,Guangzhou 510632，China; 2 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/ College of Agriculture，South China Agricultural University, Guangzhou 510642，China)

【Objective】 To investigate the effects of azadirachtin on cell proliferation，glucose uptake and insulin secretion in min6 cells and their possible mechanisms． 【Method】 The min6 cells were culturedinvitroand treated with various concentrations of azadirachtin for 48 h．Cell proliferation was measured. In the presence of 5.5 and 25.0 mmol·L-1glucose，glucose uptake was measured and insulin secretion in min6 cells were detected by the insulin ELISA kit. 【Result】 Azadirachtin promoted the proliferation of min6 cells in the presence of 5.5 and 25.0 mmol·L-1glucose compared to the control group. Compared with the 25.0 mmol·L-1glucose condition，azadirachtin in the presence of 5.5 mmol·L-1glucose more significantly promoted glucose uptake and insulin secretion in min6 cells. 【Conclusion】Azadirachtin could affect insulin secretion by regulating glucose concentration.

azadirachtin; min6 cells; cell proliferation; insulin secretion; ELISA test

2017- 03- 03 優(yōu)先出版時(shí)間：2017- 06-21

張 玲(1970—)，女，助理研究員，博士，E-mail：tzl@jnu.edu.cn；通信作者：徐漢虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail： hhxu@scau.edu.cn

廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313333)

S511； S502

A

1001- 411X(2017)04- 0025- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1923.008.html

張 玲， 王得華， 馬 義， 等.印楝素對(duì)min6細(xì)胞增殖及胰島素分泌的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(4):25- 29.