李文靜，李雪巖，崔 濤，蔡德富，樊 麗，張 昊，劉 雷，洪 博#(.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾6000;2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽006)

·實驗研究·

莪術(shù)-三棱藥對合煎液對大鼠子宮肌瘤的防治作用及機(jī)制研究Δ

李文靜1，2＊，李雪巖1，崔 濤1，蔡德富1，樊 麗1，張 昊1，劉 雷1，洪 博1#(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161000;2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110016)

目的:研究莪術(shù)-三棱藥對合煎液對大鼠子宮肌瘤的防治作用及機(jī)制。方法:將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組(米非司酮，2.25mg/kg)和藥對合煎液組(莪術(shù)-三棱藥對合煎液，6.0 g/kg)，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠分別于每周一、三、五im苯甲酸雌二醇注射液(0.5mg/kg)，持續(xù)12周;從第13周開始，造模組大鼠增加im黃體酮注射液(5mg/kg)，并每天ig給藥1次，至實驗第16周。給藥結(jié)束后，測定大鼠子宮系數(shù)，蘇木精-伊紅染色觀察大鼠子宮病理變化并測定平滑肌厚度，免疫組化染色法測定大鼠子宮組織中轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGF-β3)和基質(zhì)金屬蛋白酶11(MMP-11)蛋白表達(dá)。結(jié)果:與正常組比較，模型組大鼠子宮系數(shù)升高、子宮發(fā)生明顯病理變化、子宮平滑肌厚度增加、子宮組織中TGF-β3和MMP-11蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，陽性組和藥對合煎液組大鼠上述變化均顯著改善(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論:莪術(shù)-三棱藥對合煎液對大鼠子宮肌瘤有一定的防治作用，其機(jī)制可能與下調(diào)子宮組織中TGF-β3、MMP-11蛋白表達(dá)有關(guān)。

莪術(shù);三棱;藥對;子宮肌瘤;轉(zhuǎn)化生長因子β3;基質(zhì)金屬蛋白酶11;大鼠

藥對是中藥復(fù)方的核心，是以安全有效為特點的最小聯(lián)合用藥單元，有的發(fā)揮協(xié)同作用，有的發(fā)揮相制作用。藥對配伍符合中醫(yī)理論的“七情和合”，是中醫(yī)遣方用藥特色的體現(xiàn)[1]。子宮肌瘤是女性生殖器最常見的一種良性腫瘤，主要是由子宮平滑肌細(xì)胞增生而成，其中有少量纖維結(jié)締組織作為一種支持組織而存在[2-3]。雖然子宮肌瘤是良性腫瘤，但大部分子宮肌瘤臨床上常伴有子宮出血、腹部包塊及壓迫等癥狀，尤其極易導(dǎo)致孕期婦女不孕或流產(chǎn)，嚴(yán)重影響了女性生活及工作質(zhì)量[4-5]。關(guān)于子宮肌瘤的病因及發(fā)病機(jī)制，有報道稱與激素、免疫等因素有關(guān)[6-7]，但目前尚無定論。據(jù)報道，轉(zhuǎn)化生長因子β3(Transform ing grow th factorβ3，TGF-β3)在子宮肌瘤的發(fā)生中起著重要的作用[8];基質(zhì)金屬蛋白酶11(Matrix metalloproteinase 11，MMP-11)在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖凋亡、降解結(jié)締組織成分等方面起著核心的作用[9-10]。

莪術(shù)與三棱為破血化瘀的代表藥物，二藥伍用首見于《經(jīng)驗良方》中三棱丸[11]。莪術(shù)-三棱藥對在臨床常用于治療氣血凝滯所致的血滯經(jīng)閉腹痛、癥瘦積聚、痞塊等。目前，對于子宮肌瘤的中醫(yī)藥治療均采用活血化瘀、消癥散結(jié)的藥物，如桂技茯苓丸(膠囊)、宮瘤清膠囊、三棱丸、宮瘤消膠囊、三棱祁甲合劑、軟堅散結(jié)顆粒等，上述方中均含有莪術(shù)-三棱藥對。所以，本研究以三棱丸為基礎(chǔ)，選擇莪術(shù)-三棱藥對為研究對象，探討該藥對治療子宮肌瘤的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Nikon-ECLIPSECi顯微鏡(包括CCD成像系統(tǒng))購自日本Nikon公司;LD4-2A常溫離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);pH計、Sartorius BS 223 S電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

米非司酮片(湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號:140407，規(guī)格:25mg/片);苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液(寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號:110042511、110041439，規(guī)格:2mg/m L、50mg/m L);所有抗體以及辣根過氧化物(DAB)酶底物顯色試劑盒(批號: AR1022)均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;甲醛(分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司)。

1.3 藥材與合煎液

莪術(shù)(產(chǎn)地:安徽毫州，批號:20150329)、三棱(產(chǎn)地:安徽毫州，批號:20151104)藥材均購自毫州市國峰藥業(yè)銷售有限公司，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中藥研究室郭麗娜教授鑒定分別為姜科植物蓬莪術(shù)(Curcuma phaeocaulis)的干燥根莖和黑三棱科植物黑三棱或細(xì)葉黑三棱(Sparganium stoloniferum)的塊莖。莪術(shù)-三棱藥對合煎液由本實驗室提取(批號:160922，規(guī)格:含生藥1.25 g/m L)。

1.4 動物

Wistar大鼠40只，♀，體質(zhì)量190～210 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證編號:SCXK(京)2007-0001。動物均喂以標(biāo)準(zhǔn)滅菌鼠飼料，自由飲水。動物房設(shè)定室溫為20～22℃、濕度為40%～70%。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將40只大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、陽性組和藥對合煎液組，共4組，每組10只。各組大鼠分別于代謝籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常組外，其余各組大鼠分別于每周一、三、五im苯甲酸雌二醇注射液(0.5mg/kg)復(fù)制子宮肌瘤模型，正常組大鼠im等體積的生理鹽水，連續(xù)12周;第13周開始，造模組大鼠每周im苯甲酸雌二醇注射液后再增加im用苯甲酸雌二醇稀釋的黃體酮注射液(5mg/kg)，正常組大鼠同時im等體積的生理鹽水;并于第13周開始給藥，陽性組小鼠ig米非司酮2.25mg/kg (根據(jù)人臨床用量換算而得)，藥對合煎液組小鼠ig莪術(shù)-三棱合煎液6.0 g/kg(根據(jù)人臨床用量為每天莪術(shù)與三棱藥材各10 g的劑量換算而得)，正常組和模型組小鼠ig生理鹽水溶液2m L，每天1次，第16周后結(jié)束造模及給藥[12-13]。

2.2 子宮形態(tài)觀察及子宮系數(shù)測定

給藥結(jié)束后稱定各組大鼠體質(zhì)量，處死取出子宮，觀察每組大鼠的子宮形態(tài)改變。將子宮稱質(zhì)量后計算子宮系數(shù)[子宮質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)]，并以10%甲醛溶液固定。

2.3 HE染色后子宮病理變化觀察及平滑肌厚度測定

取每只大鼠子宮分角上0.5 cm處的一段子宮組織，用石蠟包埋于模具中，將石蠟包埋的組織塊切成適宜的厚度(5μm)，進(jìn)行HE染色后拍照，每個標(biāo)本取3張照片(×20，2張;×40，1張)。參照文獻(xiàn)[14-15]中病理分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級:0級，子宮平滑肌細(xì)胞排列均勻規(guī)則;Ⅰ級，平滑肌層少許增厚或不增厚，肌纖維排列紊亂;Ⅱ級，平滑肌層明顯增厚，大面積平滑肌出現(xiàn)穿插現(xiàn)象;Ⅲ級，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，穿插現(xiàn)象明顯，肌層成漩渦狀。并選用200倍光鏡下拍攝的照片對子宮平滑肌厚度進(jìn)行測定，每張照片計數(shù)3次，每個樣本3張照片，共計測量9次，以平均值作為該樣本的平滑肌厚度。

2.4 免疫組化染色后子宮中TGF-β3、MMP-11蛋白表達(dá)檢測

子宮切片常規(guī)脫蠟至水，室溫加入過氧化酶阻斷液10m in，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，5%牛血清白蛋白封閉液封閉后，滴加一抗(1∶100)，4℃孵育過夜。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3min;滴加生物素標(biāo)記的二抗1滴，37℃孵育20m in，PBS液洗滌3次，每次3m in;滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)溶液，37℃孵育20m in，PBS洗滌4次，每次5m in;DAB顯色，染色，封片。每只大鼠取1張免疫組化切片，置于顯微鏡下放大20倍，隨機(jī)選取5個視野拍片。應(yīng)用Image-Pro-plus軟件，計算TGF-β3和MMP-11的積分光密度(IOD)值，取這5個視野的平均IOD值作為該切片TGF-β3和MMP-11的蛋白表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS Statistics22軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗進(jìn)行組間比較;等級資料采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠子宮形態(tài)觀察與子宮系數(shù)測定結(jié)果

造模后大鼠子宮明顯增生，給藥后大鼠子宮增生不同程度減輕，并以藥對合煎液組效果最明顯，詳見圖1。與正常組比較，其余各組大鼠子宮系數(shù)均顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，陽性組和藥對合煎液組大鼠子宮系數(shù)均顯著降低(P＜0.01)，結(jié)果詳見表1。

圖1 各組大鼠子宮形態(tài)圖Fig 1 Theuterusmorphology of rats in each group

表1 各組大鼠子宮系數(shù)測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination resu lts of the uterine coefficient of rats in each group(±s，n=10)

表1 各組大鼠子宮系數(shù)測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination resu lts of the uterine coefficient of rats in each group(±s，n=10)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01，與模型組比較，##P＜0.01Note:vs.normalgroup，＊＊P＜0.01;vs.modelgroup，##P＜0.01

組別正常組模型組陽性組藥對合煎液組子宮系數(shù)，g/g 0.001 9±0.000 2 0.004 3±0.000 5＊＊0.003 1±0.000 4＊＊##0.003 2±0.000 7＊＊##

3.2 大鼠子宮病理觀察結(jié)果

正常組大鼠子宮平滑肌層較薄，平滑肌細(xì)胞細(xì)長、排列整齊;模型組大鼠子宮平滑肌呈不同程度的增生，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，肌纖維排列疏松，肌纖維或較長或粗短，肌纖維束之間有或多或少的結(jié)締組織纖維，縱行肌層和環(huán)行肌層均明顯增厚，發(fā)生明顯病理改變(P＜0.01);陽性組和藥對合煎液組大鼠子宮的縱、環(huán)行肌層的厚度較模型組薄，病理程度明顯減輕(P＜0.01)。病理觀察圖片見圖2、分級結(jié)果見表2。

3.3 大鼠子宮平滑肌層厚度測定結(jié)果

與正常組[(189.9±21.1)μm]比較，模型組大鼠子宮平滑肌厚度[(218.9±44.6)μm]顯著增加(P＜0.05);與模型組比較，陽性組和藥對合煎液組大鼠子宮平滑肌層厚度[分別為(182.7±24.4)、(181.8±28.6)μm]均顯著減少(P＜0.05)。

3.4 大鼠子宮組織中TGF-β3、MMP-11蛋白表達(dá)測定結(jié)果TGF-β3和MMP-11在各組大鼠子宮平滑肌細(xì)胞的

圖2 各組大鼠子宮HE染色圖(×20)Fig 2 HE staining chartsof rats’uterus in each group (×20)

表2 各組大鼠子宮病理分級結(jié)果Tab 2 Resu lts of uterine pathology grading of rats in each group

胞漿中均有不同程度的表達(dá)，表現(xiàn)為黃色或棕黃色的陽性細(xì)胞。與正常組比較，其余各組大鼠子宮中TGF-β3、MMP-11蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.01);與模型組比較，陽性組和藥對合煎液組大鼠子宮中TGF-β3、MMP-11蛋白表達(dá)均減弱(P＜0.01)。免疫組化圖見圖3、蛋白表達(dá)測定結(jié)果見表3。

圖3 各組大鼠子宮組織中TGF-β3、MMP-11蛋白表達(dá)的免疫組化染色圖(×20)Fig 3 Immunohistochem ical staining charts of TGF-β3，MMP-11 protein expressions of rats’uterus tissue in each group(×20)

4 討論

據(jù)文獻(xiàn)[12-13]報道，采用雌、孕激素聯(lián)合使用的方

表3 各組大鼠子宮組織中TGF-β3、MMP-11蛋白表達(dá)測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 3 Determ ination resultsof TGF-β3，MMP-11 protein expressions of rats’uterus tissue in each group(±s，n=10)

表3 各組大鼠子宮組織中TGF-β3、MMP-11蛋白表達(dá)測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 3 Determ ination resultsof TGF-β3，MMP-11 protein expressions of rats’uterus tissue in each group(±s，n=10)

注:與正常組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，##P＜0.01Note:vs.normalgroup，＊＊P＜0.01;vs.modelgroup，##P＜0.01

MMP-11，×1043.696±0.49 14.200±0.83＊＊7.582±1.27＊＊##7.900±1.53＊＊##組別正常組模型組陽性組藥對合煎液組IOD值TGF-β3，×1042.929±0.43 13.260±1.42＊＊6.653±1.08＊＊##7.323±1.26＊＊##

法進(jìn)行造模可使動物模型更加穩(wěn)定，建立的子宮肌瘤模型與人子宮肌瘤也更加相似，且發(fā)病原因也更吻合，因此在本研究中采用雌激素和孕激素聯(lián)合法制備大鼠子宮肌瘤動物模型。造模后大鼠子宮形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，正常組大鼠子宮呈Y型，質(zhì)地均勻，色澤均一呈粉色，富有彈性;而模型組大鼠子宮體積較正常組明顯增大，呈暗紅色，水腫現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)結(jié)節(jié)、囊腫，個別大鼠子宮角可見腫塊，子宮系數(shù)也比正常組顯著升高(P＜0.05)，提示造模成功。

莪術(shù)-三棱藥對配伍在臨床上被應(yīng)用于治療子宮肌瘤，本研究為了進(jìn)一步探討莪術(shù)-三棱藥對治療子宮肌瘤的藥理作用及機(jī)制，采用莪術(shù)-三棱藥對的合煎液ig給藥。結(jié)果顯示，莪術(shù)-三棱藥對合煎液ig給藥4周后，在雌、孕激素作用下過度增生的子宮受到抑制，病理變化得到顯著改善(P＜0.05)。

子宮HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠子宮明顯增厚，平滑肌纖維排列明顯紊亂，肌細(xì)胞縱橫交錯;而莪術(shù)-三棱藥對合煎液可不同程度地減輕大鼠子宮內(nèi)膜和肌層的增厚程度。免疫組化結(jié)果顯示，造模組大鼠子宮肌瘤組織和正常組大鼠的子宮肌壁組織中均有TGF-β3、MMP-11蛋白的表達(dá)，且子宮肌瘤組織中TGF-β3、MMP-11蛋白的表達(dá)明顯高于正常組織(P＜0.05)，提示TGF-β3、MMP-11蛋白與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。莪術(shù)-三棱藥對合煎液可減弱子宮肌瘤大鼠子宮組織中TGF-β3、MMP-11蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本研究證實了莪術(shù)-三棱藥對合煎液對大鼠子宮肌瘤具有一定的防治作用，可降低模型大鼠子宮系數(shù)、減少模型大鼠子宮肌層過度增生，此作用可能與其下調(diào)模型大鼠子宮中TGF-β3、MMP-11蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究為子宮肌瘤發(fā)病及治療機(jī)制的研究提供了一定的實驗依據(jù)，也為子宮肌瘤的診斷和治療提供了一個新的靶點，但其更多的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Study on the Preventive and Therapeutic Effect and Its M echanism of M edicine Pair Decoction Liquid of Curcuma phaeocaulis-Sparganium stoloniferum on Uterine M yoma in Rats

LIWenjing1，2，LIXueyan1，CUITao1，CAIDefu1，F(xiàn)AN Li1，ZHANG Hao1，LIU Lei1，HONG Bo1(1.School of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Heilongjiang Qiqihar 161000，China;2.School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China)

OBJECTIVE:To study the preventive and therapeutic effect and itsmechanism ofmedicine pair decoction liquid of Curcuma phaeocaulis-Sparganium stoloniferum on rats w ith uterine myoma.METHODS:Rats were random ly divided into normal group，model group，positive group(mifepristone，2.25mg/kg)and medicine pair decoction liquid group(C.phaeocaulis-S.stoloniferum decoction liquid，6.0 g/kg)，10 in each group.Except for the normal group，rats in other groupswere injected Estradiol benzoate injection(0.5 mg/kg)intramuscularly every Monday，Wednesday and Friday，for 12 weeks.From the 13th week，rats in modeling group were added Progesterone injection(5 mg/kg)intramuscularly as well as relevantmedicines intragastrically，once a day，until the 16th week.A fter adm inistration，uterine coefficient of rats was detected.HE staining was used to observe the pathological changes of uterus and determine the thickness of smooth muscle;immunohistochemical staining was adopted to detect the transform ing grow th factorβ3(TGF-β3)，matrix metalloproteinase 11(MMP-11)protein expressions in uterus tissue of rats.RESULTS:Compared w ith normal group，uterine coefficient was increased in model group，pathological changes were obvious in uterus，thickness of smooth muscle was increased，TGF-β3and MMP-11 protein expressionswere enhanced(P＜0.05 or P＜0.01). Compared w ith model group，above-mentioned changes were improved significantly in positive group and medicine pair decoction liquid groups(P＜0.05 or P＜0.01).CONCLUSIONS:Medicine pair decoction liquid of C.phaeocaulis-S.stoloniferum shows certain preventive and therapeutic effect on ratsw ith uterinemyoma.Themechanism may be associated w ith downregulating the TGF-β3，MMP-11 protein expressions in uterus tissue.

Curcuma phaeocaulis;Sparganium stoloniferum;Medicine pair;Uterinemyoma;Transforming grow th factorβ3; Matrix metalloproteinase 11;Rats

R965

A

1001-0408(2017)19-2609-04

2017-01-10

2017-04-11)

(編輯:林 靜)

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81403173)

＊講師，博士。研究方向:中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話:0452-2663159。E-mail:lw j022325@163.com

#通信作者:講師，博士。研究方向:中藥配伍機(jī)制。電話: 0452-2663159。E-mail:bohong200630174@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.05