吳紹康，萬曉青，毛根祥，李佳媚，顧亞君(.浙江醫(yī)院藥劑科，杭州 3003;.浙江中醫(yī)藥大學中藥體外代謝實驗室，杭州 30053)

·制劑與工藝·

3首中藥方劑代煎后的穩(wěn)定性研究Δ

吳紹康1＊，萬曉青1，毛根祥1，李佳媚2，顧亞君1(1.浙江醫(yī)院藥劑科，杭州 310013;2.浙江中醫(yī)藥大學中藥體外代謝實驗室，杭州 310053)

目的:初步考察3首中藥方劑代煎后的穩(wěn)定性，為保證代煎藥液儲存質(zhì)量、提高用藥安全性提供參考。方法:選用3首出自《傷寒雜病論》的經(jīng)典方即葛根黃芩黃連湯(A方)、五苓散(B方)、抵當湯(C方)，以自動煎藥機煎煮并包裝后分別置于常溫(25℃)與冷藏(4℃)條件下儲存，分別于第1、7、14、21、28天檢測藥液中微生物、沉淀量、pH及總黃酮、生物堿、多糖、總蛋白含量。結(jié)果:與第1天比較，在第28天時，A方常溫組總黃酮、多糖含量顯著升高(P＜0.05)，冷藏組多糖含量顯著升高(P＜0.05);B方常溫組多糖含量顯著降低(P＜0.05);C方常溫組與冷藏組的pH及總蛋白含量均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);其余指標在試驗期內(nèi)均未見明顯變化。結(jié)論:在常溫與冷藏條件下，上述代煎中藥保存至第4周時，藥液成分開始出現(xiàn)變化，提示中藥代煎后的保質(zhì)期以3周內(nèi)為宜。

代煎;中藥方劑;儲存溫度;儲存時間;穩(wěn)定性

湯劑是中醫(yī)臨床普遍使用的劑型之一，其組方靈活，能適應辨證施治、隨癥加減的用藥需要，一直沿用至今[1]。但湯劑不宜久置，必須隨煎隨服，這為其應用帶來諸多不便。為克服這一缺點，許多醫(yī)療機構(gòu)開展了自動煎藥機代煎中藥服務，患者只需將煎好并封裝好的藥液在服用前加熱即可。目前，代煎中藥缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標準，對代煎后的存放條件、保質(zhì)期限等諸多問題并沒有統(tǒng)一明確的研究結(jié)論，國內(nèi)外相關文獻報道也很少[2]。一般情況下，代煎中藥包裝袋上會標注“本包裝應常溫避光或者冷藏保存”，但是并沒有標明在這兩種保存情況下具體的保存期限;而且如果煎劑中含動物類蛋白質(zhì)、淀粉類或者糖分含量較高，其理論上的保存時間也會相應調(diào)整。因此，本試驗選取3首含常見中藥成分的方劑為代表，初步考察其代煎后在常溫(25℃)與冷藏(4℃)條件下放置不同時間后的穩(wěn)定性，為確保代煎中藥后期質(zhì)量、提高臨床服用的安全性提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

YJD20-GL十功能自動煎藥機(北京東華原醫(yī)療設備有限責任公司);TB-214精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);Allegratm Centrifuge高速離心機(美國Beckman公司);759紫外-可見分光光度計(上海奧普勒儀器有限公司)。

1.2 藥材、藥品與試劑

試驗所用中藥飲片均購自華東醫(yī)藥股份有限公司，批號分別為:葛根150420，黃芩150409，黃連150414，炙甘草150429，豬苓150410，炒白術150407，桂枝150424，水蛭150429，虻蟲131219，茯苓150422，澤瀉150407，桃仁150406，酒大黃150427;蘆丁(批號:100080-201409，純度:92.6%)、無水葡萄糖(批號:110833-201205，純度: 99.5%)均來源于中國食品藥品檢定研究院;鹽酸小檗堿對照品(上海施丹德生物技術有限公司，批號: 20150307，純度:98.5%);二喹啉甲酸(BCA)總蛋白定量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號: 20150701);營養(yǎng)瓊脂(國藥集團化學試劑有限公司，批號:20140601);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試藥液制備

3首方劑均出自《傷寒雜病論》，分別編號為A、B、C。A為葛根黃芩黃連湯(葛根15 g，黃芩9 g，黃連9 g，炙甘草6 g);B為五苓散(豬苓9 g，茯苓9 g，炒白術9 g，澤瀉15 g，桂枝6 g);C為抵當湯(水蛭10 g，虻蟲10 g，桃仁10 g，酒大黃6 g)。按上述劑量每方各自取20付藥量，煎藥機冷水浸泡30min，加熱升溫至115℃后繼續(xù)煎煮45m in，高溫封裝，每袋200m L，各40袋，即得供試藥液。各取3袋藥液于當日(第1天)進行微生物、沉淀量、pH、總黃酮、生物堿、多糖及總蛋白的檢測;然后將剩余袋裝藥液分組保存在25℃(常溫組)、4℃(冷藏組)恒溫條件下，第7、14、21、28天取樣重復檢測上述指標。

2.2 微生物檢測

參照文獻[3]方法并加以改進。準確稱取營養(yǎng)瓊脂38 g，加蒸餾水至1 000m L，121℃高溫滅菌30m in。取出，冷卻至適當溫度后轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，冷卻。無菌條件下取供試品200μL，均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)皿上，平行制備3個平皿，同時取未涂布供試品的空白培養(yǎng)皿為陰性對照。于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，按照平皿法計數(shù)菌落數(shù)目。結(jié)果試驗周期結(jié)束后，所有平皿內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)菌落生長。

2.3 沉淀量測定

將“2.2”項中取樣后剩余的藥液輕晃均勻，全部倒入離心瓶中，9 000 r/min(離心半徑為7 cm)離心15m in;輕輕倒出上清(上清留作后續(xù)試驗)，然后將離心瓶底部的沉淀全部刮下，烘箱60℃干燥4 h，稱定并記錄沉淀質(zhì)量。結(jié)果，同組樣品在不同取樣時間點干燥后的沉淀量差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明在儲存期間藥液中未發(fā)生可能導致絮凝或沉淀等明顯的理化反應。

2.4 pH測定

取“2.3”項上清，按照2015年版《中國藥典》(四部) pH測定方法進行檢測[4]。結(jié)果，與第1天比較，第28天時C方常溫組與冷藏組的pH均顯著升高(P＜0.05);其他組未發(fā)現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)，結(jié)果詳見表1。

2.4 總黃酮含量測定

表1 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后pH測定結(jié)果(±s，n=3)Tab 1 Determ ination results of the pH of each formulae under different storage tem peratures and stored for different tim(e±s，n=3)

表1 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后pH測定結(jié)果(±s，n=3)Tab 1 Determ ination results of the pH of each formulae under different storage tem peratures and stored for different tim(e±s，n=3)

注:與第1天比較，＊P＜0.05Note:vs.the firstday，＊P＜0.05

組別A方(常溫) A方(冷藏) B方(常溫) B方(冷藏) C方(常溫) C方(冷藏) 28 d 5.41±0.07 5.42±0.06 5.39±0.10 5.41±0.07 3.94±0.09＊3.91±0.07＊1d 5.39±0.06 5.39±0.06 5.34±0.07 5.34±0.07 3.75±0.07 3.75±0.07 7d 5.37±0.06 5.35±0.06 5.26±0.07 5.27±0.10 3.71±0.04 3.73±0.10 14d 5.36±0.06 5.41±0.05 5.30±0.10 5.31±0.09 3.73±0.09 3.70±0.05 21d 5.38±0.07 5.36±0.07 5.36±0.08 5.39±0.08 3.78±0.10 3.77±0.09

取“2.3”項上清，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[5]測定供試品中總黃酮含量。結(jié)果，與第1天比較，第28天時A方常溫組總黃酮含量顯著升高(P＜0.05)，其他組未發(fā)現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)，結(jié)果詳見表2。

表2 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后總黃酮含量測定結(jié)果(±s，n=3，mg/m L)Tab 2 Determ ination resultsof the content of total flavonoids of each formula under different storage tem peratures and stored for different time (±s，n=3，mg/m L)

表2 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后總黃酮含量測定結(jié)果(±s，n=3，mg/m L)Tab 2 Determ ination resultsof the content of total flavonoids of each formula under different storage tem peratures and stored for different time (±s，n=3，mg/m L)

注:與第1天比較，＊P＜0.05Note:vs.the firstday，＊P＜0.05

28 d 2.91±0.11＊2.65±0.14 0.41±0.03 0.42±0.02 0.52±0.03 0.52±0.02組別A方(常溫) A方(冷藏) B方(常溫) B方(冷藏) C方(常溫) C方(冷藏) 1d 2.57±0.17 2.57±0.17 0.41±0.02 0.41±0.02 0.51±0.02 0.51±0.02 7d 2.59±0.12 2.67±0.15 0.41±0.03 0.43±0.03 0.53±0.02 0.52±0.02 14d 2.65±0.14 2.63±0.13 0.40±0.02 0.41±0.02 0.52±0.03 0.52±0.03 21d 2.66±0.12 2.62±0.13 0.42±0.03 0.42±0.02 0.52±0.02 0.51±0.02

2.5 生物堿含量測定

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的鹽酸小檗堿對照品10.0 mg，以三氯甲烷溶解、定容制成質(zhì)量濃度為0.02mg/m L的小檗堿對照品溶液。分別精密吸取0、0.2、0.3、0.6、0.8、1.0m L小檗堿對照品溶液至20m L具塞試管中，加入三氯甲烷補足至5m L，然后依次加入pH 4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液2m L、0.05%溴甲酚綠緩沖溶液5m L (取溴甲酚綠0.05 g，用0.2mol/L氫氧化鈉溶液6m L使溶解，加磷酸二氫鉀1 g，加水使之溶解并稀釋至100 m L，即得)，劇烈振搖5min后靜置15min。取下層液體，于405 nm波長處檢測吸光度(A)[6]。以小檗堿質(zhì)量濃度(c)為橫坐標、A為縱坐標，繪制標準曲線。經(jīng)計算得回歸方程為A=40.119c+0.008 1(R2=0.991 7)。精密量取“2.3”項中相同體積上清，稀釋適當倍數(shù)，按上述方法測定A，計算供試藥液中生物堿含量。結(jié)果，在試驗周期內(nèi)，A、B方中生物堿含量均未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)，C方中未檢出生物堿，結(jié)果詳見表3。

2.6 多糖含量測定

表3 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后生物堿含量測定結(jié)果(±s，n=3，mg/m L)Tab 3 Determ ination results of the content of alkaloid of each formula under different storage temperatures and stored for different tim e(±s，n=3，mg/m L)

表3 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后生物堿含量測定結(jié)果(±s，n=3，mg/m L)Tab 3 Determ ination results of the content of alkaloid of each formula under different storage temperatures and stored for different tim e(±s，n=3，mg/m L)

組別A方(常溫) A方(冷藏) B方(常溫) B方(冷藏) C方(常溫) C方(冷藏) 1d 0.48±0.06 0.48±0.06 0.12±0.01 0.12±0.01未測出未測出7 d 0.47±0.03 0.49±0.03 0.12±0.01 0.13±0.01未測出未測出14 d 0.47±0.04 0.47±0.06 0.13±0.01 0.12±0.01未測出未測出21d 0.47±0.04 0.47±0.04 0.12±0.01 0.12±0.01未測出未測出28 d 0.46±0.05 0.47±0.04 0.13±0.01 0.12±0.01未測出未測出

取“2.3”項上清，加入一定體積無水乙醇，邊加邊攪，調(diào)整乙醇體積分數(shù)為75%，靜置6 h。離心(同“2.3”項)，棄去上清，沉淀用適量蒸餾水重新溶解，并轉(zhuǎn)移至100 m L量瓶定容;再取1m L，用蒸餾水稀釋適當倍數(shù)，得粗多糖供試液。參照前期建立的方法[7]，對所有供試藥液中多糖含量進行測定。結(jié)果，與第1天比較，第28天時A方常溫組與冷藏組多糖含量均顯著升高(P＜0.05)，B方常溫組多糖含量則顯著降低(P＜0.05)，其他組無明顯變化(P＞0.05)，結(jié)果詳見表4。

表4 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后多糖含量測定結(jié)果(±s，n=3，m g/m L)Tab 4 Determ ination resultsof the contentof polysaccharide of each formula under different storage tem peratures and stored for different time (±s，n=3，mg/m L)

表4 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后多糖含量測定結(jié)果(±s，n=3，m g/m L)Tab 4 Determ ination resultsof the contentof polysaccharide of each formula under different storage tem peratures and stored for different time (±s，n=3，mg/m L)

注:與第1天比較，＊P＜0.05Note:vs.the firstday，＊P＜0.05

組別A方(常溫) A方(冷藏) B方(常溫) B方(冷藏) C方(常溫) C方(冷藏) 28d 3.12±0.13＊3.09±0.11＊9.91±0.33＊10.33±0.52 2.29±0.13 2.25±0.13 1d 2.82±0.12 2.82±0.12 10.65±0.32 10.65±0.32 2.20±0.10 2.20±0.10 7d 2.80±0.16 2.79±0.11 10.75±0.59 10.80±0.41 2.12±0.15 2.16±0.11 14 d 2.78±0.10 2.84±0.13 10.61±0.43 10.76±0.51 2.19±0.12 2.23±0.10 21d 2.85±0.12 2.80±0.08 10.56±0.39 10.61±0.42 2.16±0.10 2.22±0.08

2.7 總蛋白含量測定

取“2.3”項上清，參照試劑盒說明書測定總蛋白含量。結(jié)果，與第1天比較，第28天時C方常溫組與冷藏組總蛋白含量均升高(P＜0.01)，其他組未發(fā)現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)，結(jié)果詳見表5。

3 討論

目前代煎中藥占中藥飲片使用的比例較大，藥品從固體飲片變?yōu)橐后w煎劑，質(zhì)量處于不穩(wěn)定狀態(tài)，其后期的質(zhì)控和管理顯得尤為重要。從化學成分與臨床應用角度綜合考慮，本試驗選取了《傷寒雜病論》中3首基礎方劑為研究對象。其中葛根黃芩黃連湯由葛根、黃芩、黃連、甘草4味中藥材組成，是治療急性腹瀉的經(jīng)典方劑[8]，黃芩、黃連含有抑菌成分，一定程度上有助于藥物儲存。五苓散由豬苓、澤瀉、白術、茯苓、桂枝5味中藥材組成，豬苓與茯苓含糖類較多，易發(fā)生降解反應與長菌[9]。抵當湯為破血逐瘀之名方，由桃仁、水蛭、虻蟲、大黃4味中藥材組成，由于含有容易變質(zhì)的油脂與動物類蛋白[10-13]，會影響藥液的儲存穩(wěn)定性。

表5 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后總蛋白含量測定結(jié)果(±s，n=3，mg/m L)Tab 5 Determ ination results of the content of total proteins of each formula under different storage tem peratures and stored for different time (±s，n=3，m g/m L)

表5 各方劑在不同儲存溫度下放置不同時間后總蛋白含量測定結(jié)果(±s，n=3，mg/m L)Tab 5 Determ ination results of the content of total proteins of each formula under different storage tem peratures and stored for different time (±s，n=3，m g/m L)

注:與第1天比較，＊＊P＜0.01Note:vs.the firstday，＊＊P＜0.01

組別A方(常溫) A方(冷藏) B方(常溫) B方(冷藏) C方(常溫) C方(冷藏) 28 d 33.84±1.26 33.18±1.59 4.75±0.29 4.95±0.21 13.61±0.57＊＊13.27±0.58＊＊1d 32.90±1.85 32.90±1.85 4.67±0.36 4.67±0.36 10.79±0.60 10.79±0.60 7d 34.11±1.75 34.60±1.50 4.60±0.29 4.64±0.26 11.45±0.50 10.92±0.43 14 d 32.40±1.18 31.21±1.77 4.79±0.49 4.72±0.39 11.79±0.63 11.80±0.45 21 d 30.51±2.05 32.33±1.44 4.57±0.30 4.83±0.19 11.84±0.51 11.77±0.52

對方劑組成進行分析后，本文側(cè)重選取了總黃酮(葛根等)、生物堿(黃連等)、多糖(豬苓、茯苓等)及蛋白質(zhì)(水蛭、虻蟲等及植物類蛋白)為檢測指標，通過檢測這些指標性成分的變化來反映藥液總體穩(wěn)定性的波動情況。小檗堿是從黃連等植物中提取出的一種異喹啉類生物堿，受水煎液溶出性及檢測方法靈敏度影響，在A、B方中的檢出值較低;而C方中所有藥味均不含生物堿類成分[11-14]，故理論與檢測結(jié)果相一致，即未檢出生物堿。由于高溫煎煮條件下藥物之間作用復雜，推測受轉(zhuǎn)化程度等因素影響(如多糖與單糖之間)，某些指標會隨時間延長逐漸發(fā)生變化，進而導致藥液后期穩(wěn)定性發(fā)生變化，但其具體原因有待進一步研究。另外，由于高溫使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能導致試驗中BCA法蛋白含量檢測結(jié)果不準，故表5數(shù)據(jù)僅供參考。

最終結(jié)果表明，在常溫及冷藏條件下，隨著時間延長，所有供試藥液均未出現(xiàn)微生物污染情況，提示嚴格的高溫煎煮及無菌包裝對煎劑在儲存中的質(zhì)量穩(wěn)定非常重要;在放置的前3周，所有方劑藥液各檢測成分均較為穩(wěn)定，至第4周時個別指標開始出現(xiàn)波動。因此，對本試驗中的3首方劑藥液保存時間均以3周內(nèi)為宜，且冷藏條件下的綜合穩(wěn)定性稍優(yōu)于常溫。

此外，本試驗作為初步探索，筆者僅設計了2個常見溫度進行考察，為了更科學、充分地探討影響藥液保存質(zhì)量的因素，今后需從擴大樣本量、細化觀察指標、增加溫度梯度等方面進行更為系統(tǒng)的研究。

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Stability Study on 3 Pieces of Chinese M edicinal Formula after Decoction

WU Shaokang1，WAN Xiaoqing1，MAO Genxiang1，LI Jiamei2，GU Yajun1(1.Dept.of Pharmacy，Zhejiang Hospital，Hangzhou 310013，China;2.Metabolism Laboratory of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

OBJECTIVE:To prelim inarily study the stability of 3 pieces of Chinesemedicinal formula(CMF)after decoction，and provide reference for guaranteeing storage quality of decocted liquid and improving safety of drug use.METHODS:3 representative formulas of Gegen Huangqin Huanglian decoction(A formula)，Wuling powder(B formula)and Didang decoction(C formula)from Shanghan Zabing Lun were selected，the decocted liquid were stored under ambient temperature(25℃)and refrigerated temperature(4℃)after decocting by automatic boiling-machine and packing.Themicroorganism，precipitation，pH and contents of total flavonoids，alkaloid，polysaccharide，total protein after 1，7，14，21，28 d were detected.RESULTS:Compared w ith the first day，contents of total flavonoids，polysaccharide in formula A at ambient temperature group were significantly increased on the 28th(P＜0.05)，content of polysaccharide in refrigerated temperature group was significantly increased(P＜0.05). Content of polysaccharide in formula B at ambient temperature group was significantly decreased(P＜0.05).The pH and content of total flavonoids in formula C at ambient temperature group and refrigerated temperature group were significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01).Other indexes showed no obvious changes during the trial period.CONCLUSIONS:Under ambient temperature and refrigerated temperature，liquid ingredients of above decocted CMF w ill change when storing for 4 weeks.It indicates that the storage time of decocted CMF should not bemore than 3 weeks.

Decoction;Chinesemedicinal formulae;Storage temperature;Storage time;Stability

R283

A

1001-0408(2017)19-2674-04

2016-10-08

2016-12-15)

(編輯:劉 萍)

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(No.2015DTA001);浙江醫(yī)院醫(yī)藥衛(wèi)生科學研究基金(No.2014YJ016)

＊中藥師，碩士。研究方向:中藥藥理與新產(chǎn)品開發(fā)。電話: 0571-81595019。E-mail:xiaokang.20@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.23