郭亞娟，曾 坤，郭換營，張校晨，張 昀#，劉繡華(.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 47500;2.河南大學(xué)天然產(chǎn)物與免疫工程重點實驗室，河南開封 47500;3.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開封 47500)

EGCG-Zn對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響

郭亞娟1＊，曾 坤1，郭換營1，張校晨1，張 昀1#，劉繡華2，3(1.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475001;2.河南大學(xué)天然產(chǎn)物與免疫工程重點實驗室，河南開封 475001;3.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開封 475001)

目的:研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與鋅離子螯合得到的EGCG-Zn對血管性癡呆(VD)大鼠的學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響。方法:將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、葡萄糖酸鋅組(陽性對照，70mg/kg)、EGCG組(5mg/kg)和EGCG-Zn低、中、高劑量組(2、5、10mg/kg)，每組10只。采用大腦中動脈閉塞法制備VD模型，造模7 d后每天ig相應(yīng)藥物1次，連續(xù)28 d。采用Morris水迷宮實驗評價各組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，分光光度比色法檢測各組大鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長，平臺象限游泳距離百分比(dP/dT)降低(P＜0.01);腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性降低，MDA含量增加(P＜0.01)。與模型組比較，EGCG組和EGCG-Zn各劑量組大鼠記錄第4天的逃避潛伏期明顯縮短，dP/dT明顯升高(P＜0.05或P＜0.01);腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性增強，MDA含量減少(P＜0.05或P＜0.01)，且呈劑量依賴性。與EGCG組和葡萄糖酸鋅組比較，EGCG-Zn各劑量組大鼠逃避潛伏期縮短，dP/dT升高;腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性增強，MDA含量減少，以高、中劑量組效果較明顯(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論:EGCG-Zn可以提高VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和抗氧化能力，且效果優(yōu)于EGCG。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯;鋅離子;血管性癡呆;大鼠;水迷宮;抗氧化;學(xué)習(xí)記憶

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是腦血管疾病的常見并發(fā)癥，是由一系列腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的癡呆綜合征?；颊叨啾憩F(xiàn)為慢性、進行性、持續(xù)性智能障礙綜合征，臨床表現(xiàn)為記憶及認知等功能障礙[1]。近年來，自由基損傷與VD之間的關(guān)系逐漸成為人們研究的熱點問題。

茶葉中所含茶多酚具有明顯的抗氧化和清除氧自由基的作用。研究顯示，茶多酚可通過抗氧化作用來減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[2]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶葉中多酚類物質(zhì)的主要成分，其能夠明顯改善VD模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力[3-4]。筆者利用EGCG上的酚羥基與鋅離子螯合得到EGCG-Zn，研究表明，其體外清除自由基和抗氧化活性均優(yōu)于EGCG[5]。本文主要研究EGCG-Zn對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響，為EGCG-Zn的進一步研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司);全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2 藥品與試劑

EGCG-Zn(河南大學(xué)天然藥物與免疫重點實驗室提供，批號:20141001，純度:≥95%);EGCG(南京春秋生物工程有限公司，批號:12050929，純度:≥98%);葡萄糖酸鋅片(海南制藥廠有限公司，批號:130102，規(guī)格:每片含鋅10mg);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，♂，體質(zhì)量220～250 g，由鄭州大學(xué)河南省實驗動物中心提供，使用合格證號為SCXK (豫)2015-0004。

1.4 其他

中動脈梗塞(MCAO)線栓(北京西濃科技有限公司，線直徑:0.26mm，線頭直徑:0.34mm)。

2 方法

2.1 建模

按文獻[6]方法，以MCAO模擬VD模型。對大鼠ip10%水合氯醛(0.5m L/100 g)麻醉后，仰位固定，分離右頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)，結(jié)扎ECA與CCA，迅速于ECA與ICA分叉處作一切口，從切口處插入線栓，遇阻力時停止進線，實現(xiàn)MCAO，縫合切口，外留1 cm線栓。假手術(shù)組大鼠僅結(jié)扎ECA與ICA即可。2 h后，觀察大鼠的行為狀態(tài)，若出現(xiàn)左側(cè)前肢蜷曲、行走轉(zhuǎn)圈或行走向左側(cè)傾倒的體征，則入選;未出現(xiàn)此體征或仍未清醒的大鼠棄用。將入選大鼠固定，提拉外留線頭直至產(chǎn)生阻力，實現(xiàn)大腦中動脈再灌注，剪去多余線栓，正常飼養(yǎng)。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、葡萄糖酸鋅組(陽性對照，70mg/kg)、EGCG組(5mg/kg)和EGCG-Zn低、中、高劑量組(2、5、10mg/kg，給藥劑量按預(yù)實驗設(shè)置)。按“2.1”項下方法，假手術(shù)組大鼠建立假手術(shù)模型，其余各組大鼠建立VD模型，始終保持每組10只大鼠。建模7 d后，各組大鼠ig相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠ig生理鹽水，每天1次，每次10m L/kg，連續(xù)給藥28 d。

2.3 空間學(xué)習(xí)與記憶能力測試

從給藥第22天開始，進行空間學(xué)習(xí)及記憶能力測試。采用Morris水迷宮進行實驗，具體參照文獻[7]方法操作。Morris水迷宮直徑200 cm、高50 cm、水深30 cm，實驗時水溫為(26±1)℃。將水池等分為4個象限，任選其一的正中放置平臺，水迷宮上方裝有攝像機，大鼠的行程可全程記錄下來。測試包括:(1)定位巡航實驗。即將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在2m in內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期)。若在2min內(nèi)未找到平臺，逃避潛伏期記為120 s。每天測2次，計算結(jié)果均值。給藥第22天開始，訓(xùn)練2 d，第24天開始進行記錄，連續(xù)記錄4 d。(2)空間探索實驗，即給藥第28天撤除平臺，在迷宮邊緣任選一點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠2min內(nèi)的游泳軌跡，分析平臺所在象限游泳路徑(dP)與總路徑(dT)之比，即dP/dT。分別以逃避潛伏期和dP/dT評價各組小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

2.4 腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量檢測

Morris水迷宮實驗后，將大鼠斷頭取腦，制備腦組織勻漿，按照測定試劑盒說明書操作，采用分光光度比色法測定各組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 水迷宮實驗結(jié)果

隨著時間的延長，各組大鼠的逃避潛伏期均有縮短趨勢。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期延長，dP/dT降低(P＜0.01)。與模型組比較，EGCG組和EGCG-Zn低、中、高劑量組大鼠記錄第3、4天的逃避潛伏期縮短，dP/dT升高(P＜0.05或P＜0.01)。與EGCG組和葡萄糖酸鋅組比較，EGCG-Zn中劑量組大鼠記錄第4天的逃避潛伏期縮短，dP/dT升高(P＜0.05);EGCG-Zn高劑量組大鼠記錄第3、4天的逃避潛伏期縮短，dP/dT升高(P＜0.05或P＜0.01)，結(jié)果見表1。

3.2 腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性降低(P＜0.01)，MDA含量增加(P＜0.01)。與模型組比較，EGCG組和EGCG-Zn各劑量組大鼠腦組織中SOD、CAT和GSH-Px活性增強(P＜0.05或P＜0.01)，MDA含量降低(P＜0.01)。與EGCG組比較，EGCG-Zn中、高劑量組大鼠腦組織中SOD活性增強(P＜0.05)。與葡萄糖酸鋅組比較，EGCG-Zn各劑量組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性增強(P＜0.05或P＜0.01)，MDA含量降低(P＜0.05)，結(jié)果見表2。

4 討論

表1 各組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期及dP/dT的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of escape latency and dP/ dT in watermaze testof rats in each grou(px± s，n=10)

表1 各組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期及dP/dT的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of escape latency and dP/ dT in watermaze testof rats in each grou(px± s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與EGCG組比較，ΔP＜0.05;與葡萄糖酸鋅組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01Note:vs.sham group，＊＊P＜0.01;vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01;vs.EGCG group，ΔP＜0.05;vs.Zinc gluconate group，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組EGCG組葡萄糖酸鋅組EGCG-Zn低劑量組EGCG-Zn中劑量組EGCG-Zn高劑量組第4天26.4±5.04 78.1±8.77＊＊64.7±12.65##69.8±15.50 60.1±11.01##54.5±12.73##△◇49.8±13.06##△◇◇逃避潛伏期，s dP/dT，% 43.56±5.11 27.96±8.28＊＊34.56±7.05#29.93±8.12 34.68±7.44#39.81±5.77##△◇41.37±8.17##△◇◇第1天61.8±20.12 102.5±14.07＊＊94.1±18.17 97.1±16.02 94.1±14.53 92.9±19.72 93.0±15.16第2天44.8±16.45 93.4±12.47＊＊87.2±14.76 89.1±18.25 86.3±18.75 83.3±14.34 79.5±12.63#第3天34.2±7.74 86.1±12.26＊＊75.6±9.43#80.2±16.30 75.5±14.28#72.9±10.45##66.8±11.06##△◇

表2 各組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 2 Determ ination results of SOD，CAT，GSH-Px activities and MDA content in brain tissue of rats in each grou(p±s，n=10)

表2 各組大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 2 Determ ination results of SOD，CAT，GSH-Px activities and MDA content in brain tissue of rats in each grou(p±s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與EGCG組比較，ΔP＜0.05;與葡萄糖酸鋅組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01Note:vs.sham group，＊＊P＜0.01;vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01;vs.EGCG group，ΔP＜0.05;vs.Zinc gluconate group，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

MDA，nmol/mgpro組別SOD，U/mgprot CAT，U/mgprot GSH-Px，U/mgprot假手術(shù)組模型組EGCG組葡萄糖酸鋅組EGCG-Zn低劑量組EGCG-Zn中劑量組EGCG-Zn高劑量組t 3.02±0.76 4.77±0.82＊＊3.87±0.81#4.31±0.74 3.70±0.82##◇3.62±0.99##◇3.59±0.67##◇157.78±15.22 130.69±15.32＊＊142.29±13.38#134.36±10.50 145.29±10.82#◇152.23±11.03##△◇◇154.17±12.19##△◇◇2.51±0.79 1.53±0.45＊＊1.96±0.60#1.54±0.43 1.98±0.56#◇2.04±0.76#◇2.23±0.70##◇◇30.80±6.08 24.31±5.35＊＊28.10±5.69◇23.57±5.45 28.55±5.47#◇28.75±6.03#◇29.62±5.33#◇

VD早期，患者的學(xué)習(xí)記憶功能會出現(xiàn)明顯的減退。Morris水迷宮常用來評價動物的學(xué)習(xí)記憶能力，經(jīng)典的Morris水迷宮實驗包括定位巡航實驗和空間探索實驗。本研究中，采用MCAO法制備VD大鼠模型，給藥28 d后，用Morris水迷宮實驗考察大鼠行為學(xué)變化。結(jié)果表明，EGCG-Zn能夠明顯改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，且改善程度與藥物存在一定的量效關(guān)系。

VD的病因較復(fù)雜，但反復(fù)腦缺血所致多部位損害是其主要病因之一，目前較多的學(xué)者認為腦缺血后自由基對神經(jīng)細胞的損害作用是VD的重要發(fā)病機制之一。研究表明，腦缺血時體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，自由基及其代謝產(chǎn)物作用于多價不飽和脂肪酸，發(fā)生氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)DNA、RNA、蛋白質(zhì)的交聯(lián)和氧化反應(yīng)，促使多糖分子聚合，從而損傷腦組織，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)及功能的改變[8-9]。 MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，隨著氧自由基的過量堆積，機體會生成過量的MDA。因此，檢測VD大鼠腦組織中MDA的含量可以間接反映大鼠腦組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度，從而了解細胞受自由基攻擊的損傷程度。SOD、CAT、GSH-Px是一類抗氧化酶，是自由基的清除劑，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，具有抗脂質(zhì)過氧化損傷的作用，對機體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用[10]。因此，檢測VD大鼠腦組織中SOD、CAT以及GSH-Px的活性，可反映機體的抗氧化能力。

EGCG具有較強的抗氧化和對抗氧自由基的作用，可上調(diào)腦組織中SOD、CAT以及GSH-Px活性，降低腦組織中MDA含量。EGCG-Zn作為其螯合物，結(jié)合金屬離子后，EGCG分子中電子云發(fā)生變化，特征活性基團酚羥基被激活，其抗氧化活性進一步增強。本研究結(jié)果顯示，VD大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px活性降低，MDA含量增加;經(jīng)過EGCG-Zn作用后，大鼠腦組織中SOD、GSH-Px、CAT活性增強，MDA含量減少，表明EGCG-Zn可提高VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和抗氧化能力，效果優(yōu)于EGCG。

[1]BomebrokeM，Breteler NM.Epidem iology of non-AD dementias[J].Clin NeurosciRes，2004，3(6):349-361.

[2]Chen YZ，Tian Y，Zhang ZL，etal.Effects of tea polyphenol on oligodendrocyte in cerebral ischem ic rats[J].J Clin Neurol，2007，20(3):211-213.

[3]孟令慧，陳福軍，商秀麗.EGCG對血管性癡呆Wistar大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響[J].解剖科學(xué)進展，2011，17(4):325-330.

[4]付正豐，李晶，岳秀永，等.EGCG抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠右心室肥厚的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21(13):126-129.

[5]王彥兵，張迪，劉秀華，等.茶多酚-鋅(Ⅱ)配合物的合成及抗氧化活性[J].河南大學(xué)學(xué)報，2012，42(4):378-383.

[6]尹軍祥，田金洲，黃啟福，等.MCAO擬血管性癡呆大鼠模型的建立[J].中國病理生理雜志，2003，19(8):1144-1147.

[7]葉翠飛，張麗，艾厚喜，等.兩種水迷宮實驗對擬癡呆模型學(xué)習(xí)記憶功能測試的比較[J].中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2004，13(3):256-261.

[8]Ferris DC，Kume-Kick J，Russo-Menna I，etal.Gender differences in cerebral ascorbate levels and ascorbate loss in ischem ia[J].Neuroreport，1995，6(11):1485-1489.

[9]Sen CK，Packer L.Antioxidant and redox regulation of gene transcription[J].FASEB J，1996，10(7):709-720.

[10]Valdez LB，Arnaiz SL，Bustamante J，et al.Free radical chem istry in biological systems[J].Biol Res，2000，33(2): 65-70.

(編輯:鄒麗娟)

Effect of EGCG-Zn on the Learning，M emory and Antioxidant Abilities in Vascular Dementia Rats

GUO Yajuan1，ZENG Kun1，GUO Huanying1，ZHANG Xiaochen1，ZHANG Yun1，LIU Xiuhua2，3(1.College of Pharmacy，Henan University，Henan Kaifeng 475001，China;2.Key Lab.of Natural Medicine and Immune-engineering，Henan University，Henan Kaifeng 475001，China;3.College of Chem istry and Chem ical Engineering，Henan University，Henan Kaifeng 475001，China)

OBJECTIVE:To study the effect of EGCG-Zn chelated by epigallocatechin gallate(EGCG)and Zn ion on learning，memory and antioxidant abilities in vascular dementia(VD)rats.METHODS:Rats were random ly divided into sham group，model group，zinc gluconate group(positive control，70 mg/kg)，EGCG group(5 mg/kg)，and EGCG-Zn low-dose，middle-dose，high-dose groups(2，5，10 mg/kg)，10 in each group.The VD models were induced by middle cerebral artery occlusion.The rats were intragastrically given relevantmedicines after 7 d of modeling，once a day，for 28 d.Morris watermaze were used to evaluate learning and memory abilities of rats.Spectrophotometric method was adopted to detect the superoxide dismutase (SOD)，catalase(CAT)，glutathione peroxidase(GSH-Px)activities and malondialdehyde(MDA)content in brain tissue of rats. RESULTS:Compared w ith sham group，escape latency was extended in model group，percentage of platform quadrant sw imming distance(dP/dT)was reduced(P＜0.01);SOD，CAT，GSH-Px activities in brain tissue were reduced，and MDA contentwas increased(P＜0.01).Compared w ith model group，escape latency on 4th d of recording was obviously shortened in EGCG group and EGCG-Zn dose groups，dP/dT was obviously increased and dose-depended(P＜0.05 or P＜0.01);SOD，CAT，GSH-Px activities in brain tissue were increased，MDA content was decreased(P＜0.05 or P＜0.01)and dose-depended.Compared w ith EGCG group and zinc gluconate group，escape latency was obviously shortened in EGCG-Zn dose groups，dP/dT was increased;SOD，CAT，GSH-Px activities in brain tissue were increased，MDA content was decreased;and the effects in high-dose，medium-dose groups weremore obvious(P＜0.05 or P＜0.01).CONCLUSIONS:EGCG-Zn can improve the learning，memory and antioxidant abilities in VD rats，and the effect is superior to EGCG.

Epigallocatechin gallate;Zn ion;Cascular dementia;Rats;Morriswatermaze;Antioxidant;Learning and memory

R965

A

1001-0408(2017)19-2642-03

2016-10-28

2017-02-06)

＊本科生。研究方向:天然藥物。電話:0371-23880680。E-mail:913279213@qq.com

#通信作者:副教授，碩士。研究方向:天然藥物。電話:0371-23880680。E-mail:zhangyun@henu.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.14