胡愛軍，宋飛瑩，鄭捷，曲瑩，曹園園

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2天津市寬達(dá)水產(chǎn)食品有限公司，天津300304）

利用檸檬酸脫除鰱魚魚鱗中鈣的工藝條件優(yōu)化

胡愛軍1，2，宋飛瑩1，鄭捷1，曲瑩1，曹園園1

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2天津市寬達(dá)水產(chǎn)食品有限公司，天津300304）

以檸檬酸為脫鈣劑，研究攪拌條件下鰱魚魚鱗的脫鈣條件，并通過掃描電子顯微鏡對(duì)脫鈣前后魚鱗的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察對(duì)比。采用單因素及正交試驗(yàn)，考察料液比、脫鈣時(shí)間及檸檬酸濃度對(duì)魚鱗脫鈣效果的影響。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶20（g/mL），脫鈣時(shí)間120 min，檸檬酸濃度3.5%，在此條件下，脫鈣率可達(dá)到95.23%，電鏡結(jié)果顯示，脫鈣能使鰱魚魚鱗的蛋白質(zhì)裸露出來，有利于魚鱗蛋白質(zhì)的提取。

鰱魚；魚鱗；檸檬酸；脫鈣；表面結(jié)構(gòu)

中國作為淡水魚大國，其產(chǎn)量一直穩(wěn)居世界前列[1]。白鰱（Hypophthalmichthys molitrix），作為中國四大家魚之一，飼養(yǎng)廣泛，2015年產(chǎn)量為435.5萬噸，少于草魚位居第二[2]。雖然我國淡水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，但水產(chǎn)品的深加工與綜合利用都低于國際水平[3]，淡水魚的加工比例僅為17%，遠(yuǎn)低于我國海水產(chǎn)品的加工比例（53.57%）[4]。在魚類加工中，大約30%的副產(chǎn)品由魚皮、魚鱗、魚骨組成，其中魚鱗約占其中的15%[5]。所有的后期副產(chǎn)品均含有豐富的蛋白質(zhì)，這些材料也作為潛在的膠原蛋白和明膠來源得到了越來越多的關(guān)注[6]。魚鱗中的膠原蛋白纖維層的結(jié)構(gòu)是正交式夾層結(jié)構(gòu)，表面有一層羥基磷灰石的覆蓋[7]，這種結(jié)構(gòu)增加了魚鱗的加工利用難度，也直接導(dǎo)致了鰱魚魚鱗不能廣泛加工利用以及大量廢棄的現(xiàn)狀。

要將魚鱗中的蛋白質(zhì)提取出來，必須先對(duì)魚鱗進(jìn)行脫鈣處理。目前，對(duì)魚鱗脫鈣的方法主要集中在鹽酸、檸檬酸脫鈣和EDTA絡(luò)合法脫鈣。劉冬姣等[8]利用響應(yīng)面法進(jìn)行了EDTA-4Na脫除魚鱗鈣的工藝優(yōu)化研究，但是文中并沒有指明所用魚鱗的種類，不同魚鱗脫鈣條件可能會(huì)有所不同；黃煜等[9]進(jìn)行了鹽酸脫除羅非魚魚鱗鈣的工藝優(yōu)化研究；陳正平等[10]用單因素正交試驗(yàn)研究了磁力攪拌輔助檸檬酸脫除鳙魚魚鱗鈣的工藝；彭元懷等[11]進(jìn)行了單因素正交試驗(yàn)優(yōu)化檸檬酸法脫除羅非魚魚鱗鈣的工藝研究；陳日春[12]研究了EDTA螯合脫除鰱魚魚鱗中鈣離子的工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最優(yōu)的脫鈣工藝條件。

考慮到脫鈣后的蛋白質(zhì)提取試驗(yàn)，有研究表明，相比于EDTA法和檸檬酸脫鈣法，鹽酸脫鈣在脫鈣的過程中會(huì)造成較大的蛋白質(zhì)損失[6]。而EDTA脫鈣法成本較高，目前在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用可能性不大。本文采用檸檬酸進(jìn)行脫鈣，不僅具有較小的蛋白質(zhì)損失率，同時(shí)還能得到具有生物活性的檸檬酸鈣。因此用檸檬酸進(jìn)行魚鱗脫鈣可以達(dá)到綜合利用的目的，實(shí)現(xiàn)資源最大化利用[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鰱魚魚鱗：收集于天津?yàn)I海金元寶農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

檸檬酸、氨水、氯化銨、鉻黑T、鹽酸羥胺、三乙醇胺、氯化鈣、EDTA-2Na、硝酸、高氯酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇、濃硫酸、石油醚：均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

FA2204B電子天平：諸暨市超澤衡器有限公司；D-8401WZ電動(dòng)攪拌器：天津市華興科學(xué)儀器廠；DH-101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；K9840半自動(dòng)凱氏定氮儀、S0X406脂肪分析儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；QSL-08消化爐：天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SU-1510掃描式電子顯微鏡：日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 鰱魚魚鱗基本成分測(cè)定

水分測(cè)定：GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》直接干燥法；灰分含量的測(cè)定：GB 5009.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》馬福爐灰化法；脂肪含量的測(cè)定：GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》微量凱氏定氮法。

1.2.2 魚鱗脫鈣工藝

原料魚鱗反復(fù)清洗，去除雜質(zhì)后40℃烘至魚鱗表面完全干燥，浸入酸液中，攪拌使體系處于全混流狀態(tài)，脫鈣一段時(shí)間，過濾，棄去濾液。脫鈣魚鱗用蒸餾水反復(fù)沖洗，40℃干燥備用。

1.2.3 脫鈣率測(cè)定

原料總鈣離子含量及脫鈣液中的鈣離子含量用EDTA絡(luò)合滴定法測(cè)定[13]。

脫鈣率計(jì)算：

式中：h1為脫鈣液中的鈣離子含量，mg/mL；h0為總鈣離子含量，mg/g；v為脫鈣液總體積，mL；m為脫鈣魚鱗質(zhì)量，g。

1.2.4 不同因素對(duì)脫鈣率的影響

檸檬酸濃度對(duì)脫鈣率的影響：稱取一定量魚鱗，按料液比1∶20（g/mL）分別加入不同濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的檸檬酸溶液（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%），攪拌脫鈣120 min，考察檸檬酸濃度對(duì)脫鈣率的影響。

脫鈣時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響：稱取一定量魚鱗，按料液比1∶20（g/mL）加入2.5%的檸檬酸溶液，進(jìn)行攪拌脫鈣，測(cè)定不同脫鈣時(shí)間（10、20、40、60、80、100、120、160、200 min）下的脫鈣率，考察脫鈣時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響。

料液比對(duì)脫鈣率的影響：稱取一定量魚鱗，分別按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g/mL）加入濃度為2.5%的檸檬酸溶液，攪拌脫鈣120 min，考察不同料液比對(duì)脫鈣率的影響。

1.2.5 脫鈣工藝參數(shù)優(yōu)化

以檸檬酸濃度，反應(yīng)時(shí)間，料液比為影響因素，依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果選擇合適的影響因素水平，以脫鈣率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)。

1.2.6 魚鱗脫鈣前后表面結(jié)構(gòu)分析

將脫鈣前的鰱魚魚鱗與脫鈣后的魚鱗冷凍干燥后，表面噴金，于掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚魚鱗基本成分

鰱魚魚鱗基本成分測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 鰱魚魚鱗基本成分分析Table 1 The composition analysis of silver carp scale

表1表明，鰱魚魚鱗中蛋白質(zhì)含量為64.23%，充分說明了魚鱗蛋白綜合利用的必要性?；曳趾枯^高，在提取蛋白之前需要先進(jìn)行脫鈣處理。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

圖1 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Ca2+

根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合出回歸方程為：y=0.089 7x-0.142 6

式中y為鈣離子濃度，mg/mL；x為EDTA滴定體積，mL；相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，相關(guān)性良好。

2.2.2 檸檬酸濃度對(duì)脫鈣率的影響

檸檬酸濃度對(duì)脫鈣率的影響見圖2。

圖2 檸檬酸濃度對(duì)脫鈣率的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on decalcification rate

由圖2可知，檸檬酸濃度低于2.5%時(shí)，隨著檸檬酸濃度的增大，脫鈣率持續(xù)升高，當(dāng)檸檬酸濃度超過2.5%后，隨檸檬酸濃度的增大，脫鈣率的升高不再明顯，3.5%之后逐漸趨于穩(wěn)定。原因可能是，檸檬酸濃度較低時(shí)，提高反應(yīng)物的濃度，能夠加快鈣離子與檸檬酸的反應(yīng)速率，使脫鈣率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)檸檬酸濃度超過2.5%后，此時(shí)體系中的檸檬酸已經(jīng)能夠滿足鈣離子的反應(yīng)需求，體系已趨于平衡，此時(shí)提高檸檬酸濃度，脫鈣率不再上升。

2.2.3 脫鈣時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響

脫鈣時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫鈣率的影響Fig.3 Effect of reaction time on decalcification rate

由圖3可以看出，脫鈣時(shí)間小于120 min時(shí)，隨著脫鈣時(shí)間的增加，脫鈣率不斷升高，當(dāng)脫鈣時(shí)間超過120 min后，進(jìn)一步提高反應(yīng)時(shí)間，脫鈣率升高不再明顯?？赡艿脑蚴?，時(shí)間小于120 min時(shí)，隨著時(shí)間增加，魚鱗中的鈣離子與檸檬酸有了更多的接觸時(shí)間，反應(yīng)更易趨近平衡，使脫鈣率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。當(dāng)時(shí)間大于120 min后，反應(yīng)體系中的鈣離子已經(jīng)基本反應(yīng)完全，脫鈣率不會(huì)再隨著時(shí)間的增加升高。

2.2.4 料液比對(duì)脫鈣率的影響

料液比對(duì)脫鈣率的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)脫鈣率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on decalcification rate

料液比從1∶10（g/mL）變化到1∶20（g/mL），脫鈣率不斷上升，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g/mL）后，進(jìn)一步提高溶液體積對(duì)脫鈣率的影響并不顯著，這可能是因?yàn)楫?dāng)檸檬酸濃度不變時(shí)，隨著溶液體積的增加，魚鱗分散得更完全，與檸檬酸的接觸更加充分，從而有利于脫鈣率的提高；當(dāng)料液比增加到1∶20（g/mL）之后，魚鱗中鈣離子對(duì)檸檬酸的需求基本達(dá)到飽和狀態(tài)，增加溶液體積，脫鈣率不再升高。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

選擇檸檬酸濃度、脫鈣時(shí)間、料液比為考察因素，以脫鈣率為考察指標(biāo)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化脫鈣工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

表3 L9（34）正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果Table 3 Range analysis of L9（34）orthogonal test

由表3中極差R可知各因素對(duì)魚鱗脫鈣效果影響程度相對(duì)大小的順序?yàn)椋簷幟仕釢舛龋痉磻?yīng)時(shí)間＞料液比。由脫鈣率所確定的最優(yōu)工藝條件組合為A3B2C2，即檸檬酸濃度3.5%，脫鈣時(shí)間120 min，料液比1∶20（g/mL）。

為了明確各因素對(duì)脫鈣率影響的顯著性，進(jìn)一步對(duì)表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果見表4。

表4 方差分析表Table 4 Results of variance analysis

由表4方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)脫鈣率均有影響，其中，檸檬酸濃度對(duì)脫鈣率有極顯著影響，脫鈣時(shí)間對(duì)脫鈣率有顯著影響，料液比對(duì)脫鈣效果有一定影響。這表明在檸檬酸脫鈣過程中，檸檬酸濃度和脫鈣時(shí)間是決定脫鈣率的關(guān)鍵因素。

由正交試驗(yàn)結(jié)果得到的脫鈣最佳工藝參數(shù)為檸檬酸濃度3.5%，脫鈣時(shí)間120min，料液比1∶20（g/mL）。這個(gè)組合沒有出現(xiàn)在正交表中，因此需要對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證：驗(yàn)證試驗(yàn)平行做3次，取平均值，測(cè)得其驗(yàn)證產(chǎn)品的脫鈣率為95.23%，大于正交表中的最大值92.30%，因此試驗(yàn)最終確定的脫鈣最佳工藝參數(shù)為：檸檬酸濃度3.5%，脫鈣時(shí)間120 min，料液比1∶20（g/mL）。

2.4 脫鈣后鰱魚魚鱗基本成分

脫鈣后魚鱗基本成分見表5。

表5 脫鈣后鰱魚魚鱗基本成分分析Table 5 The composition analysis of decalcified silver carp scale

由表5，脫鈣后魚鱗中蛋白含量達(dá)到了86.9%，基本上可以算是一種粗蛋白了，鈣質(zhì)的脫除能夠降低魚鱗蛋白質(zhì)提取的難度。

2.5 脫鈣前后魚鱗表面結(jié)構(gòu)分析

為了更直觀地分析脫鈣對(duì)魚鱗表面結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)脫鈣前后魚鱗表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行了掃描電鏡觀察。結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 未脫鈣魚鱗表面結(jié)構(gòu)Fig.5 The surface structure of undecalcified scale

通過電鏡掃描結(jié)果比較，未脫鈣的魚鱗表面比較平整致密，未見明顯的突起或凹陷，這是由于魚鱗表面被羥基磷灰石等無機(jī)礦物質(zhì)覆蓋；經(jīng)過脫鈣處理的魚鱗表面變得粗糙，出現(xiàn)規(guī)則排列的明顯條紋狀突起，這是由于魚鱗表面鈣質(zhì)被脫除，魚鱗中纖維狀的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)裸露出來，并且表面結(jié)構(gòu)變得疏松，這有利于后續(xù)蛋白質(zhì)的提取。

圖6 脫鈣后魚鱗表面結(jié)構(gòu)Fig.6 The surface structure of decalcified scale

3 結(jié)論

檸檬酸脫鈣可以脫去大部分的鈣質(zhì)，使魚鱗表面結(jié)構(gòu)變得疏松，有利于后續(xù)蛋白質(zhì)的提取。影響脫鈣率的因素主次大小順序?yàn)闄幟仕釢舛龋痉磻?yīng)時(shí)間＞料液比，其中檸檬酸濃度和反應(yīng)時(shí)間是影響脫鈣率的顯著因素。通過單因素和正交試驗(yàn)最終確定檸檬酸脫鈣的最優(yōu)工藝參數(shù)為：在攪拌條件下，檸檬酸濃度為3.5%，反應(yīng)時(shí)間為120 min，料液比為1∶20（g/mL）。在此條件下脫鈣率為95.23%，脫鈣效果良好。

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Study on Decalcification Condition of Silver Carp（Hypophthalmichthys molitrix）Scales with Citric Acid

HU Ai-jun1，2，SONG Fei-ying1，ZHENG Jie1，QU Ying1，CAO Yuan-yuan1
（1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China；2.Tianjin City Kuanda Aquatic Food Co.,Ltd.,Tianjin 300304,China）

The process conditions of citric acid removal the calcium ions from the silver carp fish-scale were studied.The surface structures of undecalcified fish scale and decalcified fish scale were observed by scanning electron microscope（SEM）.The effects of solid-liquid ratio，reaction time and citric acid concentration on the decalcification of fish scales were investigated and the optimal technological parameters were separately to be 1∶20（g/mL），120 min and 3.5%.Under the optimal conditions，decalcification rate was 95.23%.SEM results showed that decalcification could be favorable for the extraction of fish scale protein.

silver carp；fish scale；citric acid；decalcification；surface structure

2016-12-07

中國博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（2013M540211）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目“天津兩種優(yōu)勢(shì)魚種中餐工業(yè)化調(diào)理食品加工關(guān)鍵技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用”；天津科技大學(xué)科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（20110104）；天津市東麗區(qū)科技型中小企業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目“復(fù)合型魚糜制品加工關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用”

胡愛軍（1968—），男（漢），教授，研究生導(dǎo)師，博士，研究方向：食品加工及超聲技術(shù)。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.017