徐健，孫明強(qiáng)，王媛媛，張成元

（山東省濰坊市婦幼保健院1.檢驗(yàn)科，2.兒科，3.新生兒科，山東 濰坊 261011）

臨床研究·論著

熱性驚厥患兒血清中表觀遺傳標(biāo)志物的表達(dá)及臨床意義*

徐健1，孫明強(qiáng)1，王媛媛2，張成元3

（山東省濰坊市婦幼保健院1.檢驗(yàn)科，2.兒科，3.新生兒科，山東 濰坊 261011）

目的分析熱性驚厥（FS）患兒血清中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1、3A、3B（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2（EZH2）及組蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）的變化情況，探討其在FS疾病中的臨床意義。方法選取60例FS患兒，其中包括30例單純型FS（SFS）和30例復(fù)雜型FS（CFS）。另選取30例正常健康體檢兒童為正常對照組，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測比較3組間3種酶基因和蛋白之間的表達(dá)水平變化。結(jié)果①SFS組和CFS組基因表達(dá)均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；SFS組與CFS組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。②SFS組和CFS組DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4蛋白表達(dá)水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；SFS組與CFS組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。結(jié)論SFS和CFS組患兒血清中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2和HDAC4基因及蛋白水平均呈現(xiàn)高表達(dá)模式，提示表觀遺傳修飾在FS中的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，為深入研究FS的致病機(jī)制及防治FS提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

熱性驚厥；表觀遺傳；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；組蛋白甲基化酶；組蛋白去乙?；?/p>

熱性驚厥（febrile seizures，F(xiàn)S）是小兒時(shí)期較常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常的緊急癥狀[1]，一般情況下無并發(fā)癥，但突發(fā)驚厥可致外傷，嚴(yán)重持續(xù)驚厥可致腦缺氧、腦損傷。根據(jù)臨床表現(xiàn)主要分為單純型FS（simple febrile seizures，SFS）和復(fù)雜型FS（complex febrile seizures，CFS）。前者具有良好的自愈性，一般不會(huì)留下后遺癥。后者如果反復(fù)發(fā)生，具有發(fā)展成癲癇的可能性，導(dǎo)致智力低下，增加死亡的危險(xiǎn)[2]。

近年來，DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙?；缺碛^遺傳調(diào)控機(jī)制研究為驚厥或癲癇發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)[3]。研究表明[4-5]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中DNA甲基化可調(diào)控神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活性和突觸可塑性。DNA甲基化主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltranferase，DNMT）來完成的，主要維持體內(nèi)基因甲基化狀態(tài)的催化酶，尤其是DNMT1被認(rèn)為是維持DNA甲基化的關(guān)鍵酶[6]。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）作為一種重要的調(diào)節(jié)組蛋白甲修飾的酶類，主要特異性的完成H3K27的甲基化修飾。研究表明，EZH2可以介導(dǎo)H3K27甲基化從而影響神經(jīng)元的分化以及神經(jīng)退行性疾病等[7]。另一種表觀遺傳修飾酶—組蛋白去乙?；钢饕钦{(diào)控組蛋白乙?；降闹匾呋?。經(jīng)研究表明，組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 4，HDAC4）可以影響許多神經(jīng)元相關(guān)基因的異常表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，進(jìn)而影響神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。

本研究通過檢測FS患兒血清中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4的基因及蛋白表達(dá)情況，探討這些表觀遺傳修飾在FS中的臨床價(jià)值，為治療FS提供更好的臨床指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

FS組：選取2015年7月-2016年8月來山東省濰坊市婦幼保健院就診的60例FS兒童（不包括新生兒）。根據(jù)病史及臨床特征，符合FS的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中包括30例SFS患兒和30例CFS患兒。兩組分別男15例，女15例；年齡1～5歲，平均（2.9±1.2）歲。對照組：30例健康體檢兒童，排除感染或具有免疫疾病者；男15例，女15例；年齡1～5歲，平均（3.0±1.2）歲；既往均無FS及癲癇病史。所有FS患兒治療方案均告知家長，并在家長簽署同意書的情況下執(zhí)行。3組患兒性別、年齡及發(fā)熱程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 血液樣本收集SFS組和CFS組在驚厥發(fā)作后5 h內(nèi)抽取靜脈血5 m（l需EDTA抗凝）。全血樣本一部分立即進(jìn)行3 000 r/min，離心10 min，取上清冷凍保存于-80℃冰箱，準(zhǔn)備后續(xù)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測。另一部分血液樣本用于提取RNA，準(zhǔn)備后續(xù)進(jìn)行基因表達(dá)檢測。對照組血液樣本按照上述方法進(jìn)行同樣的處理。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測首先將前面提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，加入引物、DNA聚合酶，混勻后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測。PCR反應(yīng)體系如下所示：cDNA 1μl；2×SYBR Green Mix 9μl；正向引物（10μmol）0.5μl；反向引物（10μmol）0.5μl；水9μl；總體積20μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃3 min，94℃30 s，退火溫度（基因不同，退火溫度不同）15 s，72℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)。β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因。根據(jù)公式2-△△Ct=[Ct（target）-Ct（actin）]A-[C（ttarget）-（Ctactin）]B，分析各組間基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.3 ELISA檢測

按照博士德公司購買的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒說明書操作，每份標(biāo)準(zhǔn)品測3孔，取其平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間采用檢驗(yàn)，3組間采用One-way ANOVA法，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

表2 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4在FS患兒血清中的蛋白表達(dá)水平（±s）

表2 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4在FS患兒血清中的蛋白表達(dá)水平（±s）

注：1）與正常對照組比較，<0.05；2）與SFS組比較，<0.05

組別HDAC4/（ng/L）DNMT1/（μg/L）DNMT3A/（μg/L）DNMT3B/（μg/L）EZH2/（ng/L）正常對照組（=30）12±311±410±4264±32362±45 SFS組（=30）96±221）101±341）88±341）679±751）691±341）CFS組（=30）153±351）2）115±431）92±431）725±641）765±551）

圖1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因、基因表達(dá)

2.4 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4蛋白表達(dá)情況

SFS組和CFS組血清中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4的蛋白的表達(dá)情況均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），與SFS組比較，CFS組中DNMT1蛋白表達(dá)高于SFS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.011）。其余各指標(biāo)兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見表2。

圖2 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶2基因表達(dá)

圖3 組蛋白去乙?；富虮磉_(dá)

3 討論

近年來，表觀遺傳調(diào)控在許多重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病當(dāng)中起到重要的作用，例如，癲癇、阿爾茲海默病、帕金森病等[8]。FS可以使神經(jīng)系統(tǒng)中大量的神經(jīng)細(xì)胞受損，進(jìn)而影響各種信號通路之間的信號傳遞，信號通路中的各種因子受到DNA甲基化、組蛋白甲基化、乙?；刃揎椇螅淖兞说鞍椎幕钚赃M(jìn)而影響疾病的進(jìn)程。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙?；刃揎?，這些修飾可以影響緊密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變和基因表達(dá)模式的改變，并且對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等方面起到調(diào)控作用[9]。許多研究者希望能從表觀遺傳學(xué)方面解釋FS的發(fā)病機(jī)制，以期在不遠(yuǎn)的將來能尋找新干預(yù)措施。

本研究結(jié)果顯示，在SFS和CFS組中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、EZH2、HDAC4基因及蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)高表達(dá)模式，說明在FS疾病過程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的變化可能會(huì)影響某些基因甲基化狀態(tài)的改變，進(jìn)而影響FS的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)過理論分析和實(shí)驗(yàn)研究，有關(guān)科學(xué)家提出了“甲基化假說”。該假說認(rèn)為，驚厥可以使表觀遺傳染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響某些關(guān)鍵基因的表達(dá)，最終增加了導(dǎo)致驚厥或癲癇的發(fā)病條件，這種異常的表觀遺傳染色質(zhì)修飾已經(jīng)在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中被發(fā)現(xiàn)，包括自閉癥、精神分裂癥、腦腫瘤等[9]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA甲基化的關(guān)鍵調(diào)控酶，迄今發(fā)現(xiàn)主要有3種DNMTs參與基因的甲基化過程。DNMTs的表達(dá)與基因的甲基化水平呈正相關(guān)，且其改變常早于基因甲基化狀態(tài)的改變，因此，常作為基因甲基化狀態(tài)的參考指標(biāo)[10]研究表明，DNA甲基化可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育及突觸可塑性[5]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，如果敲除海馬區(qū)的DNMT基因，其突觸的形成會(huì)受到抑制。另有研究顯示，DNMT3A能夠使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向進(jìn)行分化，如果敲除該基因會(huì)使神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的神經(jīng)異常變化[11]。

本研究結(jié)果顯示SFS組和CFS組的EZH2表達(dá)高于正常對照組，表明EZH2在FS的發(fā)生發(fā)展中同樣也起到一定的作用。組蛋白甲基化水平由組蛋白甲基化酶和去甲基化酶催化決定。目前已發(fā)現(xiàn)3個(gè)家族的酶能夠?qū)-腺苷甲硫氨酸上的催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移到組蛋白氨基酸殘基[12]。組蛋白甲基化與DNA甲基化之間存在密切的聯(lián)系。在神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2可以與DNMT3A、DNMT3B相互作用[13]，受PRC2復(fù)合體調(diào)控的基因出現(xiàn)DNA甲基化。組蛋白甲基化和DNA甲基化都可以引起基因轉(zhuǎn)錄抑制，組蛋白甲基化引起基因轉(zhuǎn)錄抑制的兩種機(jī)制包括介導(dǎo)染色體局部異染色質(zhì)形成和介導(dǎo)DNA甲基化[14]。組蛋白甲基化與DNA甲基化兩種表觀遺傳機(jī)制可以通過組蛋白甲基化在DNA復(fù)制過程中將DNA甲基化導(dǎo)入到DNA鏈上的相應(yīng)位置，復(fù)制結(jié)束后甲基化DNA成為組蛋白甲基化的模板。這兩種機(jī)制之間的對話主要是通過組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶之間的相互作用來交流的。

大量研究顯示[15]，組蛋白去乙?；讣捌湟种苿┡c多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著密切的聯(lián)系。在神經(jīng)疾病條件下，組蛋白乙酰化水平被降解，去乙?；皆鰪?qiáng)，因此造成染色質(zhì)組蛋白乙?；€(wěn)態(tài)失去平衡，進(jìn)而使神經(jīng)細(xì)胞的正常功能受損，最終產(chǎn)生一系列神經(jīng)異常變化[16]。研究顯示[17]，HDAC1、HDAC4、HDAC6在小鼠海馬及杏仁核區(qū)域呈現(xiàn)高表達(dá)，癲癇可以使組蛋白去乙酰化水平增加，進(jìn)而引起組蛋白乙?；较陆?。另外，HDAC抑制劑丁酸鈉可以很好地改善腦損傷后的小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，起到一種神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本文通過檢測FS患兒血清中各種表觀遺傳標(biāo)志物的變化情況，提示表觀遺傳修飾在FS中的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。表觀遺傳標(biāo)志物作為FS一種新的潛在的臨床干預(yù)靶點(diǎn)，其抑制或者促進(jìn)驚厥或癲癇的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究，希望能夠?yàn)榕R床FS的治療提供更可靠的臨床依據(jù)。

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（張蕾編輯）

Expression and significance of epigenetic markers in serum of children with febrile seizures*

Jian Xu1,Ming-qiang Sun1,Yuan-yuan Wang2,Cheng-yuan Zhang3
(1.Clinical Laboratory,2.Department of Pediatrics,3.Department of Neonatology,Weifang Maternal and Child Care Hospital,Weifang,Shandong 261011,China)

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of epigenetic markers in the serum of the children with febrile seizures(FS).MethodsRT-PCR and ELISA were used to measure the gene and protein expressions of DNA methyltransferase 1(DNMT1),DNMT3A,DNMT3B,histone methyltransferase EZH2(EZH2),and histone deacetylase 4(HDAC4)in 60 children with febrile seizures[30 with simple FS(SFS)and 30 with complex FS(CSF)]and 30 healthy controls.ResultsThe gene expression levels of DNMT1,DNMT3A,DNMT3B,EZH2 and HDAC4 in the SFS and CFS groups were significantly higher than those in the control group(<0.05),while there were no significant differences between the SFS group and the CFS group(>0.05).The protein expressions of DNMT1,DNMT3A,DNMT3B,EZH2 and HDAC4 in the SFS and CFS groups were significantly higher than those in the control group(<0.05);there were no significant differences between the SFS group and the CFS group(>0.05).ConclusionsDNMT1,DNMT3A,DNMT3B,EZH2 and HDAC4 are highly expressed at the gene and proteinlevels in the serum of the children with SFS and CFS,which suggests that these epigenetic modifications may play important roles in the occurrence and development of FS and provides a reliable theoretical basis for further research of pathogenesis and prevention of FS.

febrile seizure;epigenetic;DNA methyltransferase;histone methyltransferase;histone deacetylase

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.007

1005-8982（2017）16-0035-05

R742

A

2016-12-19

國家自然科學(xué)基金（No：81401230）；濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No：2014001）

孫明強(qiáng)，E-mail：763050348@qq.com；Tel：0536-8089176