吳旭紅，馮晶

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.齊齊哈爾市衛(wèi)生監(jiān)督所， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

外源亞精胺對滲透脅迫下南瓜幼苗抗氧化酶活性等生理特性的影響

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.齊齊哈爾市衛(wèi)生監(jiān)督所， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

南瓜幼苗；亞精胺；滲透脅迫；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；抗氧化酶

亞精胺(Spd)作為多胺(PA)中的一種具強烈生理活性的小分子脂肪族含氮堿，對植物生長發(fā)育具有多方面的調(diào)節(jié)作用[1-2]。植物在逆境下，細胞內(nèi)常會積累大量多胺，能夠?qū)Χ喾N生物和非生物逆境作出應(yīng)答[3-4]。尤其亞精胺(Spd)，除參與植物性別分化、果實成熟與衰老等過程外，還作為逆境下的直接脅迫保護物質(zhì)，以其獨特的分子結(jié)構(gòu)，在脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中直接參與脅迫抗性機制的構(gòu)建[5]。亞精胺(Spd)和精胺(spm)在DNA復(fù)制中，因能與拓補異構(gòu)酶之間發(fā)生交互作用，穩(wěn)定酶-模板復(fù)合物；在轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)合成的后加工過程中參與其磷酸化等，從而影響DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的生物合成[6]。在植物的生長發(fā)育中介導(dǎo)了胞內(nèi)離子平衡、酶活調(diào)控、細胞分化等多種生理過程。目前，施用外源多胺已成功應(yīng)用于提高植物的抗逆性[7-9]。

我國有大量的可耕地處于干旱、半干旱地區(qū)，加之大部地區(qū)處于亞洲季風(fēng)氣候區(qū)，更加重了旱災(zāi)的普遍性和持續(xù)性。土壤水分是影響植物生長發(fā)育的主要因子[10]，在干旱逆境下，通過應(yīng)用外源調(diào)節(jié)物質(zhì)如多胺類，探索植物自身的生化響應(yīng)機制和生理變化規(guī)律，對植物避旱和耐旱能力的研究具有重要意義。劉懷攀等[11]發(fā)現(xiàn)，Spd能通過抑制NADPH氧化酶活性提高抗氧化酶活力，從而降低葉片內(nèi)ROS，達到提高玉米苗期抗旱性；段輝國等[12]報道了Spd處理能緩解滲透脅迫對小麥幼苗造成的傷害，提高小麥抗?jié)B透脅迫能力；閆剛等[13]研究表明，Spd能促進干旱處理下番茄幼苗內(nèi)糖類的轉(zhuǎn)換和利用，通過參與番茄生育早期碳水化合物的代謝，促進番茄的生長發(fā)育。以往Spd對植物逆境生理生化的影響多以玉米、小麥、大豆、水稻和蔬菜番茄、黃瓜為試材，在南瓜上的研究鮮見報道。南瓜是重要的糧食、飼料、油料及觀賞作物，早期干旱尤其是東北、西北地區(qū)頻發(fā)的春旱，嚴重制約了南瓜種植面積的擴大和產(chǎn)量的提高。本研究以南瓜為材料，通過外施不同濃度Spd，探討南瓜苗期生長、ROS的產(chǎn)生和清除、抗氧化體系的生理響應(yīng)及有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化，揭示Spd提高南瓜幼苗耐旱性的生理機制，以期為外源Spd緩解脅迫傷害及南瓜的抗逆栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試南瓜(CucurbitamoschataDuch)品種為銀輝2號，由齊齊哈爾市種子經(jīng)銷處提供。

1.2 方 法

1.2.1 試材培育 試驗于2013年3-7月在齊齊哈爾大學(xué)生化實驗室進行。精選飽滿均勻一致的南瓜種子，先經(jīng)0.1% HgCl2浸泡消毒10 min，再用去離子水反復(fù)沖洗干凈后放入55℃溫水中浸泡10 min，并不斷攪拌使水溫降至30℃恒溫浸泡6 h，之后置于鋪有三層紗布的培養(yǎng)皿中，每皿20粒，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進行催芽。將培養(yǎng)基細砂經(jīng)清水浸泡1 h，高溫滅菌3 h(130℃)，等量稱重裝盒，之后將露白后的種子播入花盆中，每盆播11粒，于人工氣候培養(yǎng)箱中(25℃/20℃±1℃，光照/黑暗：14 h/10 h，相對濕度60%～70%)，每3天用1/4 Hongland營養(yǎng)液澆灌。待幼苗第三片真葉展開時，拔除長勢差和太密集的幼苗，從人工氣候箱中取出轉(zhuǎn)為自然培養(yǎng),自然培養(yǎng)2周后，每盆定苗8株。

1.2.2 Spd溶液配制 亞精胺(Spd)為Sigma公司產(chǎn)品，先用去離子水配成100 mmol·L-1母液，4℃保存，稀釋成相應(yīng)濃度待用。

1.2.3 試驗處理 當幼苗長至4～5片真葉時，將其隨機分為三組。分別為：對照CK1：1/4 Hoagland營養(yǎng)液+葉噴蒸餾水；對照CK2：1/4 Hoagland營養(yǎng)液+PEG-6000 200 g·L-1+葉噴蒸餾水；1/4 Hoagland營養(yǎng)液+PEG-6000 200 g·L-1+葉噴 Spd(T1：0.3 mmol·L-1；T2：0.6 mmol·L-1；T3：0.9 mmol·L-1；T4：1.2 mmol·L-1)，分別用不同濃度Spd于每天8∶30和14∶30葉面噴施二次，每次噴施量為10 ml·盆-1。以葉片正反面都無溶液滴下為宜，共處理7 d。每處理32株苗，每次取樣8株，3次重復(fù)。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 幼苗生長及鮮重、干重的測定 取幼苗并將地上、地下部分分開，迅速用蒸餾水洗凈并吸干表面水分，稱取鮮重后，110℃烘箱殺青10 min，之后轉(zhuǎn)至75℃烘干至衡重，稱干重。地上部鮮重和干重以8株幼苗的平均值表示，單位為g·株-1，按干重/鮮重計算干物率(%)；根系活力用TTC法測定[14]；耐性指數(shù)%=(處理總生物量/對照總生物量)%-100%。

1.3.3 抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)含量的測定 超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮藍四唑(NBT)光化還原法測定，以抑制氮藍四唑(NBT)光化還原50%為一個酶活單位(U)表示[18]；過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性按張志良等[14]的方法測定；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性按照Nakano和Asada[19]的方法，測定1 min內(nèi)290 nm紫外吸收值的變化，酶活以μmol ASA·h-1·g-1FW表示；抗壞血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)參照李曉云等[20]的方法定量。1.3.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測定[17]脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮比色法；蒽酮比色法測可溶性糖含量；可溶性蛋白用考馬斯亮藍法；氨基酸總量用茚三酮顯色法測定。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件繪圖，用SAS統(tǒng)計軟件對平均數(shù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用最小差異法(LSD)進行多重比較和差異顯著性分析(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Spd對滲透脅迫下南瓜幼苗生長的影響

植物生長受到抑制是干旱的表觀生理效應(yīng)。由表1可見，滲透脅迫處理7 d，南瓜幼苗地上、地下部干重和根系活力均顯著低于正常生長條件，降幅分別達到34.41%、47.73%、56.06%，說明南瓜幼苗干物質(zhì)增長受阻，且對根系影響大于地上部分。不同濃度Spd處理，均使脅迫下幼苗的生物量增加，但不同濃度Spd對幼苗生物積累的影響效應(yīng)有較大差異。T3處理(0.9 mmol·L-1Spd)，地上、地下部干物質(zhì)積累分別較CK2提高了39.22%、66.29%，根系活力提高了1.81倍(P<0.05)，耐性指數(shù)降至最低，調(diào)控幼苗生長的效果最顯著。T4處理(1.2 mmol·L-1Spd)，干物質(zhì)增長和根系活力開始呈下降趨勢，耐性指數(shù)升高。Spd處理對南瓜幼苗表現(xiàn)出明顯的適宜濃度促進而高濃度抑制的雙重效應(yīng)，且根系對Spd的響應(yīng)比地上部更敏感。

表1 外源亞精胺對滲透脅迫下南瓜幼苗生長的影響

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: values with different lowercase in same column are significantly different(P<0.05), the same below.

表2 外源Spd對滲透脅迫下南瓜幼苗產(chǎn)生速率和H2O2、MDA含量及相對電解質(zhì)滲透率的影響

2.3 外源Spd對滲透脅迫下南瓜幼苗根葉保護酶活性的影響

如表3所示，滲透脅迫使南瓜幼苗葉片和根系的SOD活性均顯著增加，分別比對照升高了56.04%、63.94%(P<0.05)，SOD活性變化是ROS的誘導(dǎo)而使南瓜幼苗為抵抗和適應(yīng)滲透脅迫逆境產(chǎn)生的應(yīng)激響應(yīng)；POD活性在根系和葉片中的變化不同，滲透脅迫顯著降低了葉片POD活性，降幅達59.19%(P<0.05)，但根系酶活僅減少6.52%，并未受到顯著影響(P>0.05)；CAT和APX活性呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，滲透脅迫處理，根、葉CAT活性分別下降了28.20%、31.87%，而APX活性分別提高了102.33%、72.55%，說明在南瓜內(nèi)生性的保護機制中，SOD、APX發(fā)揮了清除ROS，以抵御和適應(yīng)滲透脅迫的重要作用。

表3 外源Spd對滲透脅迫下南瓜幼苗根、葉保護酶活性的影響

外源不同濃度Spd處理后，對南瓜幼苗根系和葉片4種酶活性的影響有所不同。隨Spd濃度升高，根、葉SOD活性在0.9 mmol·L-1Spd處理時達到最大值，顯著高于對照，達到滲透脅迫的2.00、1.83倍； POD活性峰值分別出現(xiàn)在0.9和0.6 mmol·L-1Spd處理，葉片酶活隨Spd濃度加大升幅較小，而根系從Spd濃度為0.6 mmol·L-1開始升幅顯著高于葉片； CAT活性根、葉相差較大且變化趨勢有所不同，葉片酶活性明顯高于根系；根、葉APX活性都表現(xiàn)為隨Spd濃度逐漸增大而先升后降的變化趨勢，最大值同步出現(xiàn)在0.9 mmol·L-1Spd處理，分別較對照增加了11.07倍、4.14倍。保護酶活性的變化表明，0.9 mmol·L-1Spd處理，可誘發(fā)和激活南瓜幼苗在逆境下的保護性反應(yīng)，提高植株清除ROS的能力。但隨處理強度加大，除葉片CAT活力持續(xù)升高外，1.2 mmol·L-1Spd處理導(dǎo)致酶活顯著下降，也說明這種保護性反應(yīng)是有限的，當超過防御能力的閾值時，仍會造成細胞結(jié)構(gòu)和功能的損害。

2.4 外源Spd對滲透脅迫下南瓜幼苗根系A(chǔ)SA-GSH循環(huán)抗氧化物質(zhì)的影響

ASA是存在于植物細胞質(zhì)和葉綠體的小分子抗氧化劑，既可以通過自身氧化還原狀態(tài)的可逆變化來清除由呼吸代謝和逆境壓力產(chǎn)生的ROS，也可以借助于抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(ASA-GSH)清除H2O2，來降低氧化脅迫對植物所造成的損傷。由圖1可知，滲透脅迫下，根系A(chǔ)SA含量比對照下降46.01%，差異顯著；DHA比對照增加了5.76倍，達差異極顯著。外源Spd處理后不同程度提高了根系A(chǔ)SA含量，降低了DHA水平。0.9 mmol·L-1Spd處理，ASA含量達滲透脅迫的2.88倍，DHA含量降至脅迫處理的29.34%。ASA的還原狀態(tài)是抗逆境脅迫的重要前提，0.6、0.9、1.2 mmol·L-1Spd處理，ASA/DHA分別較滲透脅迫下提高了4.68、7.26倍和2.93倍。說明外源Spd處理通過參與南瓜幼苗內(nèi)ASA-GSH循環(huán)，有效提高南瓜幼苗ASA含量，0.9 mmol·L-1Spd處理ASA/DHA達到最大值。

GSH也是胞內(nèi)過氧化物的重要清除劑。滲透脅迫GSH含量比對照下降了32.40%，氧化型谷胱甘肽(GSSG)則增加了96.31%(P<0.05)；0.6、0.9 mmol·L-1Spd處理，GSH含量分別比脅迫下提高了2.25、2.41倍，GSSG則含量降至脅迫的81.46%和69.95%；滲透脅迫處理GSH/GSSG比對照下降72.05%，GSH/GSSG比值隨Spd處理濃度加大先升后降，0.9 mmol·L-1Spd達到處理最大值，此后又下降。說明外源Spd在ASA-GSH循環(huán)中可以刺激和誘導(dǎo)GSH含量增加，減少GSSG生成，參與了ASA-GSH循環(huán)中GSH和GSSG含量的調(diào)節(jié)。

圖1 外源Spd對滲透脅迫下南瓜根系A(chǔ)SA、DHA、GSH、GSSG含量及ASA/DHA和GSH/GSSG的影響

Fig.1 Effects of exogenous Spd on ASA，DHA，GSH，GSSG contents and ASA/DHA and GSH/GSSG ratios of pumpkin roots under osmotic stress

2.5 外源Spd對滲透脅迫下南瓜幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

南瓜葉片游離氨基酸含量在滲透脅迫下大幅升高，處理7 d時達對照的2.74倍。外源Spd處理后，南瓜葉片的氨基酸含量均顯著下降，且隨處理濃度加大游離氨基酸的積累呈先降后升的變化趨勢。0.9 mmol·L-1Spd處理效果最為顯著，葉片游離氨基酸含量降至滲透脅迫處理的54.19%。植物體內(nèi)的可溶性蛋白多為參與代謝活動的酶類，滲透脅迫逆境，葉片可溶性蛋白含量大幅下降。0.6、0.9 mmol·L-1Spd處理，蛋白質(zhì)含量分別比滲透脅迫升高了61.47%、48.52%(P<0.01)。由此表明，適宜劑量的Spd處理，可顯著抑制南瓜葉片可溶性蛋白含量的下降。推測為以多聚陽離子狀態(tài)存在的多胺，與胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)之間因電荷效應(yīng)抑制了蛋白質(zhì)的降解或促進了某些蛋白質(zhì)的合成。

表4 外源Spd對滲透脅迫下南瓜葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

可溶性糖是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脅迫導(dǎo)致可溶性糖含量升高。Spd各處理分別比脅迫逆境增加了48.93%、84.14%、70.86%、13.98%，說明在逆境下，0.6、0.9 mmol·L-1Spd處理通過對碳代謝關(guān)鍵酶水平的調(diào)節(jié)，增加了光合碳同化產(chǎn)物積累，細胞滲透勢下降，保持了細胞膨壓和各種代謝的正常進行，提高了干旱逆境中南瓜幼苗的滲透保護能力。脯氨酸既是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，又是抗氧化物質(zhì)。當植物遭受滲透脅迫時，由于生理缺水，體內(nèi)脯氨酸大量積累。表4顯示，滲透處理使南瓜葉片脯氨酸含量比對照提高了140.18%(P<0.05)。外施Spd后不同程度促進了脯氨酸含量的提高，0.6、0.9、1.2 mmol·L-1Spd處理，脯氨酸含量分別達到對照的4.08、4.75、4.42倍。由于脯氨酸是多集中于細胞質(zhì)中的不帶靜電荷無毒的偶極含氮化合物，有極強的水合能力，因此在滲透脅迫環(huán)境下有助于細胞持水，通過調(diào)控自身水分平衡，緩解了南瓜幼苗遭受的脅迫傷害。0.9 mmol·L-1Spd處理既保持了細胞與環(huán)境的滲透平衡，提高了細胞的保水能力，有效調(diào)控了南瓜葉片的脯氨酸代謝。

3 討 論

根系是植物對滲透脅迫環(huán)境感應(yīng)最早和最敏感的器官。本試驗中滲透脅迫下，南瓜幼苗的地上、地下部干物重顯著降低，根系活力的大幅下降而使幼苗耐性指數(shù)升至最高，與同期對照比較，對根系的影響明顯大于地上部分。其可能原因為逆境下ROS增加，過氧化傷害導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)受損，光合碳同化產(chǎn)物減少，游離氨基酸總量和可溶性蛋白減少。在形態(tài)建成過程中，C/N代謝受阻，尤其是碳架不足，以及滲透調(diào)節(jié)能耗損失較大等由于滲透脅迫導(dǎo)致的生理干旱的原因而抑制了南瓜生長。外源Spd處理后，不同程度促進了干物質(zhì)積累，提高了根系活力和耐性指數(shù)。0.9 mmol·L-1Spd葉面噴施后，顯著緩解了對根系和地上部分的生長抑制。表明外源Spd通過與膜結(jié)合，直接調(diào)控了膜的流動性，間接調(diào)節(jié)了膜結(jié)合酶的活性[6]，顯著提高了旱害下南瓜幼苗的持水能力，緩解了水分虧缺造成的發(fā)育障礙，促進了細胞擴展和植株生長。這與宋維賢等[21]應(yīng)用Spd促進了玉米幼苗生長的研究結(jié)果一致。劉懷攀等[11]的研究也證明了外源Spd可以通過抑制玉米葉片質(zhì)膜NADPH氧化酶活性，從而減少了ROS的生成，減輕了滲透脅迫對玉米幼苗的傷害。

ASA是抗氧化系統(tǒng)中高豐度小分子抗氧化劑，能與有毒的H2O2在APX的催化下進行反應(yīng)，自身首先被氧化成單脫氫抗壞血酸(MDHA)，MDHA繼續(xù)氧化生成脫氫抗壞血酸(DHA)，而H2O2在GSH提供的電子和還原力(NADPH)的作用下還原為H2O，從而解除H2O2的毒性。ASA可以由DHA和MDHA在DHA還原酶(DHAR)和MDHA還原酶(MDAR)作用下再生。本試驗滲透脅迫使南瓜根系A(chǔ)SA含量下降，其可能原因為：一是脅迫逆境抑制了ASA的合成速度；二是脅迫下植物體內(nèi)ROS大量生成，ASA作為抗氧化劑參與了自由基的猝滅而自身被氧化，并同時導(dǎo)致DHA含量的升高和ASA/DHA比值的下降。外源Spd緩解了滲透脅迫下南瓜幼苗根系A(chǔ)SA含量的下降，降低了DHA含量，0.9 mmol·L-1濃度的Spd維持了各處理最高的ASA/DHA比值，進一步說明，Spd通過影響滲透脅迫下GSH-ASA代謝循環(huán)而調(diào)控了細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，并通過提高ASA再生和合成途徑中的酶活性增強了南瓜幼苗的抗氧化能力。GSH是植物細胞內(nèi)含量豐富的巰基化合物，作為巰基保護劑，可以有效還原S-S鍵，因此其胞內(nèi)含量水平與機體的抗氧化能力密切相關(guān)。本研究的結(jié)論也表明，滲透脅迫降低了GSH含量和GSH/GSSG，0.9 mmol·L-1Spd提高了脅迫環(huán)境下南瓜根系的GSH含量，降低了GSSG含量，提高了GSH/GSSG。已有證據(jù)表明，GSH/GSSG可作為胞內(nèi)信號分子，對相關(guān)基因的表達、翻譯速率、蛋白質(zhì)巰基化以及酶活進行直接調(diào)控[24]。在ASA-GSH循環(huán)中，GSSG以NADPH作為還原力和電子供體還原為GSH，推測Spd通過提高該代謝途徑的關(guān)鍵酶谷胱甘肽還原酶(GR)活力，維持了GSH的高含量水平和適合的GSH/GSSG，使之處于有利于抵御氧化損傷的胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)。

植物在發(fā)育過程中，不斷需要氨基酸來合成自身組織蛋白和功能性含氮有機物，滲透脅迫逆境下，游離氨基酸總量激增，可能是蛋白質(zhì)對內(nèi)源蛋白酶的敏感性升高，加速了貯存蛋白的水解所致。Spd處理后，首先由于氧自由基的清除，光合碳同化的改善促進了碳流的運轉(zhuǎn)，大量游離氨基酸參入到蛋白質(zhì)的合成中；其次適度增加的氨基酸為維持細胞水勢起到了一定的滲透調(diào)節(jié)作用?？扇苄蕴呛透彼岫际侵参矬w內(nèi)公認的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，本研究結(jié)果表明，0.6、0.9 mmol·L-1Spd提升了可溶性糖的積累，0.9 mmol·L-1Spd更有效地促進了光合碳代謝向氮代謝的轉(zhuǎn)化，脯氨酸含量的大幅升高，推測外源Spd通過激活谷氨酸途徑中脯氨酸合成的限速酶和關(guān)鍵酶活性促進了脯氨酸的積累，同時也提高了分解代謝關(guān)鍵酶ProDH的活性，加速了在南瓜葉片內(nèi)的轉(zhuǎn)化和利用。李州等[23]對白三葉(Trifoliumrepens)脯氨酸代謝的研究也證實，水分逆境下，Spd提高了脯氨酸合成途徑(谷氨酸途徑)合成代謝關(guān)鍵酶Δ’-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和分解代謝關(guān)鍵酶脯氨酸脫氫酶(ProDH)活性，促進了水分脅迫下脯氨酸的代謝。南瓜葉片經(jīng)Spd(0.6、0.9 mmol·L-1)處理后，可溶性蛋白大幅度增加，其可能性為：一是Spd作為信息分子，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，誘導(dǎo)了逆境蛋白相關(guān)基因的高水平表達，增加了蛋白質(zhì)的合成；二是在蛋白質(zhì)翻譯后，多胺可與胞內(nèi)原有的蛋白質(zhì)發(fā)生共價交聯(lián)，穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，減緩了蛋白質(zhì)的降解[5]。

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Effects of extraneous spermidine on antioxidant enzyme activities and other physiological characteristics of pumpkin seedlings under osmotic stress

WU Xu-hong1, FENG Jing-min2

(1.CollegeofLifeSciences，AgricultureandForestry，QiqiharUniversity，Qiqihar,Heilongjiang161006，China;2.QiqihaerHealthInspectionInstitute，Qiqihar,Heilongjiang161006,China)

pumpkin seedling； spermidine； osmotic stress； osmoregulation substance； antioxidant enzyme

1000-7601(2017)04-0255-08

10.7606/j.issn.1000-7601.2017.04.39

2016-05-20

黑龍江教育廳科學(xué)技術(shù)項目(10551332)

吳旭紅(1962—)，女，黑龍江齊齊哈爾人，教授，主要研究方向為植物營養(yǎng)學(xué)和生物化學(xué)。E-mail:wvg25583681129@sina.com。

S642.1

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