石洪超　楊能英　何風(fēng)雷

[摘要] 目的 建立評價更年寧質(zhì)量的方法。方法 采用薄層鑒別（TLC）的方法對更年寧中牡丹皮、白芍、丹參進(jìn)行薄層定性鑒別。采用高效液相色譜法（HPLC）測定更年寧中的特征性成分黃芩苷的含量。選用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，流動相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；檢測波長為280 nm。結(jié)果 在TLC色譜圖中可以檢出牡丹皮、白芍、丹參的特征斑點(diǎn)，且各斑點(diǎn)清晰，易于觀察。黃芩苷在92.4～924 ng范圍內(nèi)進(jìn)樣量與其峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9998）。平均加樣回收率為99.79%，RSD為1.33%（n=6）。該方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。結(jié)論 本文建立的方法可提供更年寧的質(zhì)量評價方法，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、無干擾且簡便。

[關(guān)鍵詞]質(zhì)量控制；更年寧；薄層鑒別；高效液相色譜法

[中圖分類號] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（b）-0141-04

[Abstract]Objective To establish the method for the quality control of Gengnian Ning.Methods Moutan Cortex，Paeoniae Radix Alba，Salvia Miltiorrhiza of Gengnian Ning were identified by thin layer chromatography （TLC）.The content of baicalin （characteristic component of Gengnian Ning） was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）.The ZORBAX Eclipse XDB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm） was used，the mobile phase was methanol-water-phosphoric acid （47∶53∶0.2）and the detection wavelength was 280 nm.Results Moutan Cortex，Paeoniae Radix Alba，Salvia Miltiorrhiza could be detectable by TLC and the spots were clear for observation.In the range of 92.4-924 ng，baicalin showed a good linear relationship between sample size and its peak area （r=0.9998）.The average recovery was 99.79% with RSD=1.33% （n=6）.The method had good precision，stability and repeatability.Conclusion The established method is simple，accurate，reliable，reproducible and with strong specificity，which can be used for the quality control of Gengnian Ning.

[Key words]Quality control；Gengnian Ning；Thin layer chromatography；High performance liquid chromatography

更年寧由柴胡、黃芩、白芍、墨旱蓮、人參、黨參、郁金、香附（醋炙）、當(dāng)歸、薄荷、川芎、玄參、茯苓、法半夏、石菖蒲、牡丹皮、陳皮、干姜、白術(shù)（麩炒）、丹參、王不留行（炒）、女貞子（酒炙）等22味中藥組成。更年寧處方源于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第六冊（標(biāo)準(zhǔn)編號WS3-B-1138-92），功效為疏肝解郁，益氣養(yǎng)血，健脾安神[1]?，F(xiàn)執(zhí)行的更年寧標(biāo)準(zhǔn)中只有顯微鑒別和墨旱蓮的薄層鑒別，無含量測定項目，內(nèi)容簡單，難以評價更年寧的內(nèi)在質(zhì)量特性。本文通過實驗研究，發(fā)現(xiàn)白芍、牡丹皮、丹參的薄層色譜特征性強(qiáng)，斑點(diǎn)清晰，可以列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時增加了高效液相色譜法（HPLC）測定黃芩中黃芩苷的含量測定，以期更好地控制更年寧的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀型號為Waters 2695；檢測器的型號為Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；Sartorious（CP225D）十萬分之一天平，Sartorious（BS110S）萬分之一天平。SB-5200DT超聲波清洗機(jī)（300 W，40 Hz）。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號：110736-201426）、丹參酮ⅡA對照品（批號：110766-200416）、黃芩苷對照品（供含量測定用，批號：110715-200212），來源均為中國藥品生物制品檢定所。更年寧（10批水蜜丸）及陰性樣品均由廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司提供，乙腈為色譜純；水為Millipore 去離子水；磷酸、乙醇、甲苯、乙酸乙酯和三氯甲烷等試劑均為AR。

2方法與結(jié)果

2.1丹參的薄層鑒別試驗

更年寧樣品供試液的制備：取更年寧樣品適量，粉碎成細(xì)粉，取約10 g， 加三氯甲烷70 ml，超聲30 min，過濾，蒸干溶劑，用1.5 ml乙醇將殘渣溶解，即得[2-3]。

丹參酮ⅡA對照品供試液的制備：取丹參酮ⅡA對照品約2.5 mg，置5 ml的容量瓶中，加入乙醇溶解，用乙醇稀釋至刻度，即得。

丹參陰性對照溶液的制備：按更年寧的制備工藝，去掉丹參藥材，制成缺丹參的陰性樣品。取該樣品適量，粉碎成細(xì)粉，按上述更年寧樣品供試液的制備方法制備，即得。

檢測方法：照薄層色譜方法試驗，吸取更年寧樣品供試液、丹參酮ⅡA對照品供試液、丹參陰性對照溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯 （19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下觀察薄層色譜特征斑點(diǎn)，見圖1。

實驗結(jié)論：更年寧樣品色譜中，在與對照品丹參酮ⅡA色譜相對應(yīng)的地方，都有暗紅色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，在丹參陰性對照色譜中未見，因此丹參陰性對照無干擾，可以列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2牡丹皮、白芍的薄層鑒別試驗

更年寧樣品供試液的制備：取更年寧樣品適量，粉碎成細(xì)粉，取約5.0 g，加入40 ml甲醇，超聲提取40 min，過濾，蒸干溶劑，用5 ml甲醇將殘渣溶解，即得[4]。

芍藥苷對照品供試液的制備：取芍藥苷對照品約5 mg，置5 ml的容量瓶中，加入乙醇溶解，用乙醇稀釋至刻度，即得。

雙陰性（牡丹皮、白芍） 供試液的制備：按更年寧的制備工藝，去掉牡丹皮、白芍2味藥材，制成它們的雙陰性樣品。取該樣品適量，粉碎成細(xì)粉，按上述更年寧樣品供試液的制備方法制備，即得。

檢測方法：照薄層色譜方法試驗，吸取更年寧樣品供試液、芍藥苷對照品供試液、雙陰性（牡丹皮、白芍） 供試液各3 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。見圖2。

實驗結(jié)論：更年寧樣品色譜中，在與對照品芍藥苷色譜相對應(yīng)的地方，都有藍(lán)色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，在雙陰性（牡丹皮、白芍）色譜中未見。因此牡丹皮、白芍的雙陰性無干擾，可以列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對本產(chǎn)品的質(zhì)量控制有一定的意義。

2.3黃芩苷的含量測定方法及方法學(xué)考察

2.3.1 含量測定方法

更年寧樣品供試液制備：取本品適量，粉碎成細(xì)粉，取約0.35 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入50 ml 70%乙醇，密塞，精密稱定，超聲提?。ǔ曨l率為40 kHz，超聲功率為250 W）30 min，放冷，再次稱定重量，以70%乙醇補(bǔ)足重量，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得[5]。

黃芩苷對照品溶液制備：精密稱取黃芩苷對照品（60℃減壓干燥4 h）4 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每毫升含黃芩苷40 μg的對照品溶液。

色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；檢測波長為280 nm；柱溫為30℃；流速為1 ml/min；理論塔板數(shù)以黃芩苷峰計≥3000。

測定方法：分別精密吸取黃芩苷對照品溶液與更年寧樣品供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3.2 方法學(xué)考察

2.3.2.1 專屬性 按更年寧的制備工藝，去掉黃芩藥材，制成黃芩的陰性樣品。取該樣品適量，粉碎成細(xì)粉，按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備黃芩陰性對照溶液，分別吸取黃芩苷對照品溶液、更年寧樣品供試液、黃芩陰性對照溶液各10 μl，依法測定。更年寧樣品色譜圖中，在與黃芩苷對照品色譜相對應(yīng)的位置上，有相同保留時間的色譜峰，而黃芩陰性對照品色譜無干擾，表明本法有專屬性，可以作為含量測定指標(biāo)，見圖3。

2.3.2.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取黃芩苷對照品母液（0.0924 mg/ml）1、2、4、6、8、10 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為9.24、18.48、36.96、55.44、73.92、92.4 ng/μl的對照品溶液，分別吸取10 μl注入液相色譜儀，平行進(jìn)樣各兩次，以兩次峰面積平均值為縱坐標(biāo)、黃芩苷進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，繪制黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：Y=3442.8X-35 951（r=0.9998）。結(jié)果表明黃芩苷進(jìn)樣量在92.4～924 ng范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量之間的線性關(guān)系良好。

2.3.2.3 精密度試驗 取同一批更年寧樣品（批號：2014 1001），按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依次進(jìn)樣6次，依法測定。經(jīng)測定供試液中的黃芩苷色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.31%，顯示該液相色譜具良好的精密度。

2.3.2.4 重復(fù)性試驗 取更年寧樣品（批號：20141001）6份，每份精密稱取0.35 g，按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依法測定，黃芩苷的含量為3.91 mg/g，RSD為0.22%（n=6），結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好。

2.3.2.5 穩(wěn)定性 取更年寧樣品（批號：20141001），按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依次在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，依法測定，測得黃芩苷的平均峰面積為875481.5，RSD為0.25%（n=6）。結(jié)果顯示供試液在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.2.6 準(zhǔn)確度（回收率試驗） 取更年寧樣品（批號：20141001）6份，每份約0.18 g，精密稱定，依次分別每份添加黃芩苷對照品溶液（0.3776 mg/ml）2 ml，按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依法測定，依測得數(shù)據(jù)計算樣品回收率，結(jié)果見表1。黃芩苷的平均回收率為99.79%，RSD為1.33%（n=6）。

2.3.2.7 樣品含量測定 取更年寧樣品10批，按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依法測定，按測得數(shù)據(jù)計算供試液中的黃芩苷含量，結(jié)果見表2。

3討論

在薄層鑒別試驗中，白芍的薄層鑒別特征斑點(diǎn)主要是芍藥苷，對處方中白芍的薄層鑒別進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)樣品中陰性有干擾，經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料，處方中白芍和牡丹皮均含有芍藥苷，因此，建立了白芍和牡丹皮雙陰性的薄層鑒別方法；對處方中的川芎、當(dāng)歸的薄層鑒別進(jìn)行了研究，分別對川芎、當(dāng)歸的薄層做了比較試驗，川芎和當(dāng)歸的單陰性樣品有干擾，考慮到川芎和當(dāng)歸本身色譜特征很相似，經(jīng)常作為雙陰性的形式出現(xiàn)，同時考察了缺川芎和當(dāng)歸兩味藥材雙陰性的干擾情況，進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)更年寧中當(dāng)歸、川芎的雙陰性也有干擾[6]；對處方中玄參、干姜、白術(shù)、香附、王不留行、郁金和陳皮的薄層鑒別進(jìn)行了研究，但樣品和陰性的色譜特征斑點(diǎn)相似度很高，基本沒有區(qū)別，表明陰性對照試驗有干擾[7-13]；對處方中人參、薄荷、石菖蒲、黨參、柴胡和法半夏的薄層鑒別進(jìn)行了研究，但樣品和對照藥材的色譜斑點(diǎn)顏色有差異，且Rf值也有偏移，可能由于該處方成分復(fù)雜，其它成分干擾影響其斑點(diǎn)的顯色和成分的展開[14-19]。

在含量測定研究中，本品處方由22味中藥組成，白芍中有效活性成分芍藥苷、牡丹皮中有效活性成分丹皮酚，但芍藥苷和丹皮酚的陰性有干擾，專屬性不好，因此，正文中選擇了黃芩作為含量測定對象，以其有效活性成分黃芩苷作為指標(biāo)成分，建立了黃芩苷的含量測定（高效液相色譜法）。分析方法驗證結(jié)果表明該測定方法專屬、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。對樣品的提取方法進(jìn)行了考察，超聲提取45 min和回流提取3 h的提取效率接近，考慮到操作的簡單、方便，選擇超聲提取。在此基礎(chǔ)上，對超聲時間（30、45、60 min）進(jìn)行了比較，超聲30 min后，樣品溶液中的黃芩苷的含量不再增加，說明30 min超聲已經(jīng)完全，故確定樣品的超聲時間為30 min。

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（收稿日期：2017-06-28 本文編輯：許俊琴）